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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题意义： 水稻斑点叶突变属于水稻中常见的变异类型。由于在该突变体的叶片上会发现有很多大小、形状各异的病斑而得名。又因为这些病斑的特征与水稻在受到病原菌侵害时发生的超敏反应类似，而该突变体并没有受到明显的逆境胁迫，所以又称其为类病变突变体[1]。在大多数情况下，病变的出现伴随着与病原体相关的标记物的组成性表达：自荧光酚类化合物的积累、胼胝质的沉积、反应荧光中间体（ROIS）的产生、防御基因的组成型表达及水杨酸水平的升高等[2]。此外，这些突变体对病原菌的抗性也会受到影响：类病变突变体的特点是在没有致病基因的情况下发生的坏死性病变，其遗传缺陷往往导致对拓扑性病原体感染的抗性和防御反应基因结构性表达增强。虽然并不是所有导致类病变突变的基因都参与了防御途径，但许多类病变突变体都表现出广谱抗性，这使得它们成为鉴定具有多重抗病性基因的有力工具[3]。因此，对水稻类病变突变体进行生理特性分析就显得格外重要。 国内外研究情况： 1965年，日本学者Sekiguchi发现了第一个自然突变的水稻斑点叶突变体，这种突变体后来被称为sekiguchilrsion（sl）突变体，这个突变由一个隐性基因所控制。近年来随着基因组学及相关技术的发展，通过人工手段即物理、化学、生物的方法诱导水稻类病变突变体的例子越来越多。迄今，国际水稻遗传学协会注册和记录的斑点叶突变体表型有17个，分别命名为spl1-11、bl1-6。斑点的颜色方面，以褐色居多，例如spl26、spl16等，此外，还有白色斑点，如spl20等。斑点的形状同样变化很大，有圆、椭圆和线型等。但这些表型均属数量性状，随观察者不同，对其的描述可能存在一定差异。现在普遍接受的分类方式为将其分为两类：如果斑点的位置和大小相对比较稳定，则称其为起始突变体；如果斑点在叶片上产生后可以扩散到植株其他部位，则称其为反馈突变体。这种分类的依据是两种不同的控制细胞死亡的方式。起始突变体可形成一定大小的坏死斑，而反馈突变体则无法控制病变的范围和发生率[4]。 由于spl突变体所表现出来的数量抗性可能与其遗传背景有关，因此必须在相同背景下对表型及其遗传互作进行精确分析。科学家们在单一遗传背景下使用多重诱变剂进行诱导，并提取大量性状与类病变表形相似的植株。结果发现，病害多发生在水稻幼苗期的早期，随着叶片的成熟，病斑的大小和数量通常会增加。一些突变体具有独特的发育特征，例如在spl21中，苗期和分蘖期初期的病害明显，而后期却不明显。还有一些突变体的发生和严重程度可能是由于环境的变化而引起的。环境因素，如温度和光照，已经被证明在水稻突变体的行成中起作用[5]。 类病斑处发生的细胞死亡，与超敏反应（HR）一样都属于细胞凋亡。而细胞凋亡在植株正常发育中起着重要作用。细胞凋亡与细胞坏死不同，其发生过程受到基因的严格调控，故又被称为细胞程序性死亡（PCD）。超敏反应（HR）是研究的最多的一种细胞凋亡方式。绝大多数类病变突变体都表现出了类似HR的一些特征，现阶段对细胞死亡的知识有一部分就是来自于对这类突变体的研究。在过去的几十年中，科学家们鉴定了几种类病变突变体(LMM)，为探索植物细胞凋亡途径提供了有用的工具。由于分子遗传学的进步，使得大量LMM表型的突变基因及其相关的抑制子被定位[6]。 有很多生物大分子被发现与类病变突变有关，如酰基转移酶、锌指蛋白、泛素连接酶、热激蛋白、与网格蛋白相关的受体蛋白复合体等。它们可以帮助水稻更好地抵抗逆境，并产生类似HR的表型[7]。 应用前景： |
类病变突变体水稻对很多种病原菌都表现出了较强的抗性，已有研究表明可用人工方法，如单一光照、低温等诱导类病变突变体发生。另外，还可利用类病变基因结合其他抗病基因，将其应用于提高水稻品种抗病的广谱性和持久性同时保持产量和品质。
| 参考文献： [1] 黄奇娜，杨杨，施永峰，吴建利，陈洁.水稻斑点叶变异研究进展[J]. 中国水稻科学，2010，24 [2] 肖桂青,张元夫,杨必能,刘步蟾,周嘉豪,张海文.植物类病变突变体研究进展[J].分子植物育种,2017,15(01):290-299.
[7[[6] Quentin Bruggeman, Cécile Raynaud, Moussa Benhamed, Marianne Delarue.To die or not to die? Lessons from lesion mimic mutants. Frontiers in PLANTSCIENCE, 2015.
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2. 研究的基本内容和问题
| 1. 研究目标： 1）考查从水稻品种日本晴突变体库中筛选鉴定到的一个类病变突变体jw10的苗期表型及成熟期农艺性状特征； 2）分析jw10突变体的生理特征，明确其类病变表型产生的原因。 2.研究内容： 1) 以野生型为对照，观察水稻类病变突变体jw10苗期的生长情况，考查其地上部和根部的长度、鲜重、干重，观察其叶片类病变表型发生的过程和特征；在成熟期，着重观察其株高、穗长、每穗颖花数、结实率、千粒质量、单株产量等指标，并与野生型对照； 2) 细胞程序性死亡（programmed cell death ，PCD）的检测。用台盼蓝染色法鉴定细胞PCD。 3) 叶片衰老相关生理指标的测定。测定其H2O2、O2- 的含量、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性； 4) 检测其抗性标记基因PR1a、PR1b、PBz1、PO-C1和激素合成基因如茉莉酸（JA）合成基因OSLox2、OSAos2、OSAoc4、OPR7以及水杨酸（SA）合成基因OSEDS1、OSPAD4、OSPAL的表达量变化。 3. 拟解决的关键问题： 1) 了解jw10突变体类病变表型产生的生理原因； 2) 了解jw10突变体类病变表型产生的生理原因。 |
3. 研究的方法与方案
| 1.研究方法： |
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对比法：通过与同一生长期野生型水稻对比，比较突变体苗期表型和农艺性状以及其生理特性的一些变化，分析突变对其产生的影响。
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化学染色法：用DAB染色法检测细胞中H2O2含量、用NBT染色法测定O2-含量。
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酶活性测定法：利用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来测定酶的活性。
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台盼蓝染色法：观测细胞的PCD现象。
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RT-PCR：观察抗性标记基因和激素合成基因的表达变化。
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实验方案：
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同时播种突变体和野生型，待发芽后观察水稻类病变突变体苗期的生长情况，尤其是其地上部和根的长度、鲜重、干重等数据（添加类病变表型观察）；待抽穗期时着重观察其株高、穗长、每穗颖花数、结实率、千粒质量、单株产量等指标，并与野生型对照，比较突变体与野生型的异同；
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取苗期突变体叶片细胞与野生型叶片细胞，加入终浓度为0.1mmol/L的VP-16，继续培养36~48h，取细胞悬液，加入2%的台盼蓝染色液染色2min，加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。
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取苗期突变体与野生型叶片，分别测定其有关叶片衰老的各项生理指标，利用DAB染色法测定细胞中H2O2含量、NBT染色法测定O2-含量，用有关公司提供的试剂盒测定MDA含量、SOD和CAT的活性。
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将细胞内的基因进行RT-PCR检测。提取细胞的RNA，对其进行反转录，再利用PCR法扩增。实验数据的处理方法拟采用相对定量分析，利用2-△△Ct法：每个样本做3个平行孔，每组实验做3个重复之后做统计分析，设置空白和阴性对照。首先，分别求出每个样品的平均Ct值（Ct值取15-35定量），应用参照基因对突变体样品和野生型样品进行校正。
△Ct（对照组）=Ct目的基因—Ct内参基因
△Ct（实验组）=Ct目的基因—Ct内参基因
然后，对突变体样品和野生型样品的△Ct进行统一化：
△△Ct=Ct（对照组）—Ct（实验组）
最后，根据△△Ct算出突变样本和野生型样本基因表达量的差异：
比率（实验/对照）R=2-△△Ct
还可进行溶解曲线分析，判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。
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4. 研究创新点
| 目前国内外关于水稻生长类病变突变体的研究较为丰富与深入，也有多种突变基因被定位克隆，但关于水稻生长类病变突变体的研究大多在基因层面，关于水稻突变体的具体表型与生理特性尚不明确。而本研究所用水稻类病变突变体jw10是新发现的，其遗传分析及基因定位尚未被研究，通过对突变体的表型和生理特性进行研究并利用基因定位和图位克隆手段将该基因分离，可以为研究该基因在水稻生长发育中的分子机制奠定基础。
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5. 研究计划与进展
2019年3月：播种突变体和野生型，并每天观察记录其生长状况；待水稻长到苗期时测量突变体和野生型的株高、干重、鲜重、根长等。
2019年4月：观察该植株的各种生理特性。检测其抗性标记基因和激素合成基因表达量的变化，测量突变体和野生型穗长、每穗颖花数、结实率、千粒重、单株产量等农艺性状。
2019年5月：整理实验数据，撰写毕业论文。
