金针菇AMPK基因的克隆、沉默菌株构建及功能研究开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

金针菇（Flammulina velutipes）是一种传统的食用菌，别名冬菇、朴蕈、绒毛柄金钱菌等。其盖滑，柄脆、味鲜，营养极其丰富,每百克鲜菇含水89.739克，蛋白质2.729克、脂肪0.139克、灰分 0.839克、糖5.459克、粗纤维1.7克，铁0.22毫克、钙0.097毫克、 磷1.48毫克、钠0.22毫克、镁0.3l毫克，钾3.7毫克、维生素Bl 0.29毫克、维生素B2 0.2l 毫克、维生素C 2.7毫克,其含有多糖、糖蛋白、蛋白聚精、火菇素、火菇毒素、倍半萜等多种生物活性物质。据测定，金针菇氨基酸的含量非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，具有很高的药用价值，在国际市场上被誉为“超级保健食品”。近年来，消费者对金针菇的需求与日俱增，如何进一步提高金针菇的产量和品质成为当前重要的研究方向。

AMPK，全称为Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase。其为AMP依赖型蛋白激酶，在细胞中扮演能量状态传感器角色，是生物体内的能量调控开关，通过微调合成代谢和分解代谢途径来维持能量储存，它可以感知生物体内能量水平的降低，进而打开分解代谢来增加能量的生成，关闭合成代谢来减少能量的消耗。AMPK与多种信号通路均存在联系，如它可以抑制Tor来促进自噬、调控生物体内NADP 和NAD 等的稳态、调控线粒体的生成和功能、通过磷酸化ACC来调节脂质的代谢等。在酿酒酵母中与AMPK同源的为Snf1蛋白激酶（Snf1/AMPK家族中的一种），是在非发酵碳源生长时被发现的，对于酵母应对营养胁迫发挥重要作用，此外，有研究报道，在酵母中， Snf1蛋白激酶可以被离子胁迫、碱性pH、氧化胁迫等非营养胁迫所激活；在动物体内，线粒体呼吸链抑制剂也可以激活AMPK，这些研究表明，AMPK除了应对营养胁迫外，在非营养胁迫下也发挥一定的功能。

最近，朱旭东课题组发现AMPK同源基因组snf1参与小孢拟盘多毛孢的初级代谢、细胞壁合成以及对渗透压的感应，snf1的破坏延迟了气生菌丝的生长，降低了分生孢子的数量，同时pestalotiollide B不再产生，这说明Snf1是参与次级代谢的关键因子。

AMPK的主要功能有调节机体的能量代谢、维持能量的供求平衡、靶向治疗肿瘤等。并且SNFl／AMPK通道相关研究主要集中在酵母领域，较少涉及丝状真菌，特别在食用真菌领域，此通道研究更为稀少。因此本实验旨在初步探究对于金针菇AMPK 的功能以及AMPK对金针菇次级代谢的影响，拓宽我们对于 AMPK 在金针菇中功能的认识，进一步探寻如何提高金针菇的产量和品质。

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研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

研究方法

利用human,skeletal muscle中AMPK、Saccharomycescerevisiae中Snf1、Oryzasativa中Snf1基因编码的氨基酸序列，在金针菇基因组数据库中进行tBLASTn发现了金针菇的AMPK同源序列（6150）。利用基因克隆技术克隆金针菇AMPK基因，通过实验室前期构建的沉默载体构建AMPK沉默载体，通过脂质体转化技术得到沉默菌株，测定菌丝生长数据及各种氨基酸含量。

技术路线

实验方案

1. 设计引物：用Primer5.0设计目的基因沉默片段的特异引物

AMPKi-F:ACTGGGTACCATCCCTTAGATCGCATAAC

AMPKi-R:ACTGACTAGTTGGAGACCGAGAGCCTGTG

2. PCR扩增目的片段

3. 制胶、跑胶：用凝胶电泳成像仪观察PCR之后的电泳条带，挑选出有条带的引物，完成第一轮筛选

4. 割胶回收

5. 碱裂解法提取质粒

6. 金针菇中硝酸还原酶基因沉默片段、沉默载体（PMI）的双酶切与回收：将酶切后的产物用琼脂糖凝胶电泳验证，并将酶切后的目的条带进行柱式DNA胶回收试剂盒回收

7. 将沉默基因片段与沉默载体片段进行酶连

8. 转化与送测

9. 原生质体制备

10.脂质体转化

11.RNA提取

12.qRT-PCR

13.测定菌丝的生长指标及赖氨酸、精氨酸含量，测定金针菇蛋白质

可行性分析：

在本实验室（应用真菌实验室）食用菌研究中已经积累了丰富的经验，实验

技术、方法成熟。实验室成功建立了基因的沉默技术及过表达技术，这些遗传操作手段为下一步研究基因的功能提供优良的前提。AMPK 的研究手段和方法

在动物及酵母中已经较为成熟，能为我们提供广阔的思路和成熟的技术方法。

本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中，可以在一年内

完成课题，并完成结题报告。