灵芝Hog1 MAPK基因的沉默和表型分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、研究意义

灵芝（ganoderma lucidum (leyss. ex. fr)karst）属于真菌界（mycota），真核真菌亚界（eukaryomycota），真菌门（eumycota），担子菌亚门（basidiomycotina），层菌纲（hymenomycetes），非褶菌目（aphyllophprates），灵芝菌科（ganodermataceae），灵芝属（ganoderma）^[1]。灵芝是著名的大型药用真菌，在中国有十分悠久的应用历史。我国有灵芝属真菌20多种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝、树舌等。

灵芝是中国传统的扶正固本、滋补强壮中药，《神农本草经》将其列为上品，有益肺气，益肝气，益脾气之功效。由于其特殊的药用价值，在现代药物研究中，灵芝有效成分的分析及药理作用研究已引起了国际上的关注，相关工作主要集中在三萜、多糖、一些蛋白质等药用活性成分上。三萜类化合物作为灵芝的主要药用成分之一，具有镇静、抗氧化、抗病毒、降血压和抗肿瘤等活性，其含量的高低是目前衡量灵芝质量的重要指标，三萜类物质是灵芝的次级代谢产物，通过甲羟戊酸途径合成^[2]。通过研究对灵芝三萜合成起调控作用的基因，了解其机理，对提高灵芝药用成分含量无疑将大有帮助。

2. 研究的基本内容和问题

1、研究目标

获得hog1的沉默转化子，对其表型进行分析，了解hog1在灵芝的生长发育以及次生代谢中的功能。

2、内容

3. 研究的方法与方案

1、研究方法

(1)灵芝菌丝体提取RNA的方法

① 样品裂解：取灵芝菌丝50~100 mg置于研钵，加液氮快速研成粉末。在液氮完全挥发前，取10~20 mg移入已加入800L RNA iso plus的离心管中，立即剧烈振荡摇匀。

② 室温静置5 min，12000 rpm，4C，离心5 min。

③ 吸取上清移入新离心管中，加入1/5体积（140-150L）氯仿，剧烈振荡15s以混匀，室温放置5min，12000 rpm，4C，离心15 min，分为三层。

④ 将上层水相小心移至另一离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min。

⑤ 12000 rpm，4C，离心10 min，小心弃上清。

⑥ 在离心管中加入600L 70%乙醇，轻轻颠倒离心管混匀片刻后，12000 rpm，4C，离心5 min，小心弃上清。

⑦ 室温静置干燥3 min左右（放冰盒上），加入30L无RNase的ddH₂O溶解5min，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

(2)DNA回收方法：

① 1％琼脂糖凝胶电泳分离条带。

② 透析袋准备：剪长约3cm透析袋浸于ddH₂O中，并煮沸数分钟，用夹子夹紧一端，装约200~300μL的ddH₂O（基本填满）。

③ 电泳结束后，紫外下切下目的片段所在胶块装于透析袋，加适量ddH₂O，用夹子夹紧另一端。

④ 将透析袋装于电泳槽内自阴极向阳极电泳10min，再反向电泳15s。

⑤ 电泳结束后，取1.5mL离心管，将袋内液体转移至管中，并再洗涤透析袋。

⑥ 加2倍体积无水乙醇、1/10体积3M NaAc (pH5.2) 于-20C沉淀30min，12000 rpm离心5min，弃上清，吸干，100μL 75％乙醇洗涤沉淀，12000 rpm离心3min，弃上清，37℃晾干，沉淀溶解于适量ddH₂O中。

(3)灵芝原生质体电击转化

① 碱裂解法制备质粒。

① 收取28℃静置培养（间或摇匀，约半天摇一次）三天半的灵芝菌丝，6000rpm，9min去除培养基。

② 0.6M甘露醇洗涤两次，每次6000rpm，10min。将洗涤后的菌丝移入10ml的离心管中，6000rpm，9min，去除残余的甘露醇。

④ 依每300mg湿菌丝加1ml 2％酶液，30℃酶解2h，并间或摇匀（30min摇一次）。

⑤ 5000rpm，10min，去除酶液，用电击缓冲液洗涤两次，每次4000rpm，8min。

⑥ 按电转样品数加入相应的电击缓冲液，重悬。

⑦ 加入质粒DNA(每200μL体系加1μg DNA)。

⑧ 把上述混合物置于冰上冰浴10min，进行电击（电击条件为：2.5kV/cm, 25μF, 400欧姆），电击后再冰浴10min。

⑨ 把上一步处理的菌液加入的5ml的上层CYM（含有50mg/L kan和100mg/L hyg）培养基中，混匀，平铺于下层CYM培养基。28℃再生培养7-10 天。

⑩ 将转化子挑取到PDA平板上进行5次传代培养，然后再回接到含有100mg/L hyg抗性PDA平板，仍能够生长的为初步得到的转化子。

挑取再生的转化子于含有150ug/ml潮霉素(hyg)的CYM平板上进行抗性筛选，待生长约10天后，选取潮霉素抗性较好的转化子于CYM平板上生长约一周，然后打孔接种于100ml CYM液体培养基中培养灵芝液体种子，28℃ 150rpm摇床培养7天，然后在超净台上用种子粉碎器粉碎，接种于100ml CYM液体培养基中,每瓶接种4-5ml液体种子，28℃ 150rpm摇床培养7天,收取菌丝进行RNA提取或60℃烘干，检测三萜含量。

(4)灵芝三萜含量测定

采用分光光度法测量胞内灵芝三萜含量：① 样品制备：精确称取烘干样品0.5g/0.2g，用95%乙醇浸泡样品，定容至25ml/10ml，超声波破壁2h，每20min摇一次，吸取1ml，4000rmp离心10min，取400μl上清备用② 空白制备：准确吸取100μl95%乙醇于干燥的10ml试管中③ 样品制定：准确吸取100μl上清于干燥的10ml试管中，加香草醛（香兰素0.5g 冰醋酸10ml溶解，现配现用）200μl，高氯酸500μl，混匀，呈棕黄色，于60℃水浴中保温20min，溶液呈黑色。取出后迅速用冰水冷却10min，再加5ml冰醋酸混匀，于550nm测吸光值。

2、技术路线

3、实验方案及可行性分析

（1）实验室已经有实验的大部分实验设备

（2）实验室已经建立的灵芝的电击转化体系

（3）实验室建立了对灵芝重要的次生代谢产物灵芝三萜含量的测定

4. 研究创新点

Hog 1基因在其他真菌中已经有过很多的研究，但是在大型担子真菌中的功能还未见报道，研究了Hog1-MAPK 途径在灵芝中的作用，会更清楚的从分子生物学的角度了解灵芝，为更好地了解灵芝的一些途径搭建平台，提高相关次生代谢产物的合成如灵芝三萜等，提高了灵芝的有效代谢产物的产量、食用与药用价值。

5. 研究计划与进展

研究计划

1、2013.12-2014.2 查阅资料，整理实验思路，学习实验的基本方法

2、2014.2-2014.3 构建灵芝的hog1的沉默载体