1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
钙离子是最重要的细胞信使物质，钙信号调控着几乎所有的生命过程,包括细胞的电生理活动。细胞钙信号紊乱可以导致很多重要疾病的发生发展，其中心血管疾病尤为突出。我们课题组前期的研究表明，细胞内钙释放受体（ryr）稳定蛋白敲除可以导致成年雄性小鼠心脏生理性肥大，心肌和平滑肌细胞钙火花特性改变。最近我们发现ryr调控基因fkbp12.6突变引起小鼠年龄依赖性心力衰竭以及心肌细胞电生理特性改变，但发生这种现象的机制不清楚。因此，本项目将在我们课题组前期工作的基础上，应用分子（细胞）生物、电生理、现代生物成像等技术，结合基因突变/转基因动物模型，在分子、细胞、以及在体完整心脏水平上，深入研究fkbp12.6基因敲除导致年龄依赖性心力衰竭的病、生理变化，以及发生这些改变的分子机制，以期为心力衰竭的防治提供新的理论基础和可能的和新的靶点分子。
参考文献：
cardani, r., bugiardini, e., renna, l.v., rossi, g., colombo, g.,valaperta, r., novelli, g., botta, a., and meola, g. (2013). overexpression ofcugbp1 in skeletal muscle from adult classic myotonic dystrophy type 1 but notfrom myotonic dystrophy type 2. plos one8, e83777.
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本项目的总体目标是通过研究揭示fkbp12.6基因敲除导致年龄依赖性心力衰竭发生发 展的病-生理变化及其分子机制， 以期为心力衰竭的防治提供新的分子靶点，具体目标包括：
1） 阐明fkbp12.6敲除老龄小鼠心肌细胞ca2 释放受体相关蛋白ryr2、ip3rs、serca，心衰基因anp、bnp，以及cicr偶联相关基因jp-2和cav-3的表达和功能变化表；
3. 研究的方法与方案
本项目旨在研究fkbp12.6基因突变导致年龄依赖性心力衰竭发生发展的病生理变化及机制,涉及包括分子生物学、现代成像、电生理以及基因操作等现代生物综合技术和方法。因此，我们在实验方案的设计上，力求简单易行、稳定而且重复性好的原则，以使本项目得以顺利进行。下面我们将结合研究内容把研究方案加以叙述，并对可行性和实验之中可能遇到的难点加以分析。
1） fkbp12.6敲除对老龄小鼠心肌细胞ca2 释放受体及其相关调节基因表达的影响：本部分将采用常规实时荧光定量pcr和 western blot 法（详细方法略），分别在rna 和蛋白水平上检测野生和fkbp12.6基因敲除小鼠不同年龄段心肌细胞ryr2、ip3rs、serca、anp、bnp、jp-2（junctophilinisoform 2）和cav-3 表达和功能变化。
2） fkbp12.6敲除对老龄小鼠心肌细胞ca2 稳态的影响：本部分将采用电生理及共聚焦成像研究心肌细胞ca2 变化。探讨fkbp12.6 敲除对老龄小鼠心肌细胞cicr偶联效率的影响将采用王世强等发明的松箝（loose-seal patchclamp）技术并结合钙成像技术，记录单个lcc的钙流入（钙小星）触发ryr钙释放（钙火花）的过程；研究fkbp12.6 敲除对老龄小鼠心肌细胞sr ca2 储量的影响时将分离的心肌细胞用fluo-4 am(10 um)装载，10 mm 咖啡因喷灌细胞，共聚焦线扫（x-t，1500 hz）记录钙信号；细胞基础ca2 浓度测定：将分离的单个心肌细胞用含10 m fura-2 am(invitrogen)台氏液在37℃孵育5分钟（fura-2 am储备液溶于含20% pluronic f-127的dmso中），孵育好的细胞移入专门的显微镜记录皿中，待细胞沉底后缓慢灌流20分钟以洗去多余的染料，将皿置于倒置荧光显微镜载物台上， fura-2的荧光信号由波长为510nm的荧光所激发，发射光分别由340nm和380nm的滤光片接收，细胞内相对ca2 浓度由f340/f380比值来进行估计； 研究fkbp12.6 敲除对老龄小鼠心肌细胞ca2 释放及其特性影响时，将采分别用patch clamp-共聚焦联合应用的技术和场刺激的方法进行，同步记录细胞膜电流（或电位）、钙火花和钙瞬变，并对钙火花、钙瞬变的特性、动力学参数以及它们与膜电位的关系进行统计分析。
4. 研究创新点
目前还没有关于FKBP12.6 对衰老影响的报道。FKBP12.6是重要的结合蛋白，对FKBP12.6对心衰的研究，可能会为心力衰竭的防治提供新的理论基础和可能的新靶点分子。
5. 研究计划与进展
2013年12月：2014年2月：鉴定小鼠基因型，rna水平检测蛋白含量
2014年3月：2014年4月：蛋白质水平检测蛋白含量及研究心肌细胞ca2 变化
2014年5月：写毕业设计论文
