培根加工过程中脂质氧化：微生物及生物胺的变化规律开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：中式干腌培根作为深受广大消费者喜爱的一种发酵肉制品，其在加工过程中易发生脂质氧化过度、有害微生物污染、生物胺大量积累等严重影响食品质量安全的重大问题。研究培根加工过程中脂质氧化，微生物及生物胺的变化规律有助于阐明这些问题的关键所在，从而探索其调控机制，为干腌肉制品加工过程中调控脂质氧化，控制生物胺的积累及微生物数量提供理论依据，从而提高干腌肉制品的风味品质，保证食品安全。

国内外研究概况:早在20世纪90年代，国内外就有了对于脂质氧化、生物胺的少量研究。近些年来，随着食品安全问题的日益突出，对食品潜在安全隐患的相关研究成为了食品科学领域的一大热点。研究表明生物胺在食品中的过量积累会对人体健康产生影响，此外，食品脂质过氧化也会严重影响其风味品质。食品加工过程中脂质氧化及生物胺的积累问题已经成为了食品加工安全方面的研究热点。目前，国内外对生物胺的产生、毒性、分布以及检测方法都有了一定的研究基础，但对于具体的如何控制生物胺积累以及其变化规律并没有研究清楚，需要针对一些易产生生物胺积累的食品进行深入研究。此外，食品的脂质过氧化会严重影响食品的风味品质，缩短食品货架期，是食品品质劣变的重要原因之一。目前国内外在脂质氧化检测方法研究的基础上进行了更多的抗氧化物质研究，用以控制脂质氧化，因为影响脂质氧化的因素很多，所以很多多因素控制实验有待进一步研究，具体到某一特定食品上，由此可进行一些加工工艺上的优化，从而提高食品品质。

应用前景：发酵肉制品是人们经常食用的一类产品，然而其在发酵生产过程中往往会因为一些环境条件或者自身因素导致生物胺积累或脂质过氧化，造成企业巨大的经济损失，也对人们身体健康造成潜在的影响。本课题所研究的干腌培根也是干腌发酵肉制品的一种，因其独特的风味品质深受广大消费者青珠。脂质氧化是干腌肉制品加工过程中风味形成的必要途径，也是影响产品安全品质的重要因素。因此，千腌肉制品脂质氧化机理研究一直是肉品科学研究的一个重要方向，但有关干腌肉制品脂质氧化调控机制的研究才刚刚起步，以干腌培根为实验对象深入研究脂质氧化机理，通过加入一些抗氧化剂调控脂质氧化，从而优化干腌培根加工工艺，提高培根风味品质，在企业生产中具有很大的应用价值，可以产生巨大的经济效益。生物胺在发酵食品中广泛存在，特别是氨基酸丰富的发酵肉制品，其中的生物胺主要由游离氨基酸经氨基酸脱羧酶脱羧形成。发酵肉制品中的生物胺受原料肉、微生物、加工和贮藏条件等多种因素的影响。通过对干腌培根中生物胺积累及微生物菌群变化规律的研究，可以有效控制干腌培根加工过程中的生物胺含量，确保食品的安全性，为企业生产带来安全的技术保障，为消费者带来安全放心的食品，具有重大的实践意义。综上所述，本课题的研究具有广阔长远的应用前景。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标:通过实验方法检测干腌培根在加工过程中脂质氧化进程及生物胺的积累量，分离鉴定产胺微生物，研究其微生态变化，分析生物胺积累和产胺微生物数量之间的变化规律，揭示生物胺积累机理。

研究内容:

1 比较多酚类植物提取物(茶多酚、葡萄籽提取物和姜辣素)和ve(对照)对干腌培根的抑菌效果，以及控制生物胺累积，测定产胺微生物(细菌总数、肠杆菌、微球菌、乳酸菌、酵母和霉菌)动态变化，tvbn、生物胺含量以及氧化指标tbars；

3. 研究的方法与方案

研究方法：以干腌培根的整个加工过程为实验主线，在不同时期分别对其进行各项实验指标的测定，过程中设立对照组，从而获得数据进行分析。

主要技术路线：干腌培根的加工制作→培根发酵成熟过程中各个时期对应的理化指标测定→培根中产胺微生物的分离鉴定→培根脂质氧化指标测定→生物胺含量测定

主要实验方案如下：

1. 原料及干腌培根加工方法：

从超市购买新鲜五花肉，将其分割成18块平均重1.2kg，形状基本保持一致的长条形肉块，然后在4℃条件下冷却24小时。冷却结束，从中随机抽取三块作为原料对照组进行分析测定，剩余的五花肉块都用2.7%(g/100g肉)的食盐采用在表面擦盐的方式在4℃、相对湿度85%-90%条件下腌制3天。腌制结束，将样品转移到控温控湿培养箱中进行风干成熟，时间12天，其间温湿度程序为起始温度13℃、环境湿度85%，然后随着风千成熟时间的进行温度每天升高 1.5℃、相对湿度每天降低0.5%。分别于主要工艺点随机抽取3块样品，然后分别取等量表面和中间部位的肌肉将其切碎、混匀，用不透光真空袋真空包装，-40℃条件下冷藏备用。具体取样工艺点、生产天数和取样时的工艺温度如表1-1所示：

干腌培根加工过程中的取样工艺点

2. 理化指标测定：

水分含量测定:按 ISO1442:1997方法进行。

盐分含量测定:按ISO1842-l:1996方法进行。

pH测定:精确称取10g肉样于 80ml离心管中，然后加 10ml蒸馏水用高速匀浆机匀浆1min，匀浆结束后立即用pH计测定匀浆物的pH值，每次测定重复三次。失重率测定:在加工过程中每次取样后立即对其称重，然后利用公式Eq.2-1-1计算样品的失重率。

%weight loss=（A一B）/A x100% ( Eq.2-1-1)

上式 :%weight loss代表失重率；A代表原料样品的重量，单位g；B代表取样时样品的称重量，单位g。

总脂肪提取：总脂肪提取根据FolchJ方法取5.0g肌肉切碎，称取2.0g于离心管加25ml氯仿:甲醇(2:1)，匀浆60秒转移到带塞量筒中定容到 40ml，静置半小时过滤除去蛋白、结缔组织，加0.22倍体积的盐水(根据肌肉中水分含量估算加入量，使氯仿甲醇:水二8:4:3，有利于提取脂质)，静置2h分层或 3000rpm离心 15min，吸净上层液体(水、甲醇、离子杂质)，剩余液体转移至平底烧瓶，用旋转蒸发器在40℃水浴真空蒸干溶剂，残留物于-20℃条件贮存备用。

3. 产胺微生物的分离鉴定：

3. 1 优势菌的富集

将每个肉样在无菌条件下剪取20 g，并在无菌条件下剪碎后放入装有180 mL 灭菌生理盐水的三角瓶中，室温230 r /min 摇床摇1 h，各取1 mL 分别用MRS 和MSA 对乳酸菌、葡萄球菌/微球菌37℃条件下培养24 h。

3. 2 产生物胺氧化酶菌的分离

3. 2. 1 分离

分别从富集培养液中取出1 mL 培养液，逐级稀释后，再从10 － 5， 10 － 6， 10 － 7 中各取1 mL 涂布于对应的产胺菌下层分离培养基上。37℃培养72 h 后，无菌条件下，在下层培养基上倒上一层对应的上层培养基( 50℃) 显色，并在5 min 内记录实验结果，显紫色的为阳性( 即产胺菌) ，不变色即黄色为阴性。对阴性菌进行氧化酶试验，检验其是否具有氧化酶活性，其实验方法为: 取白色洁净滤纸沾取菌落，加1%盐酸二甲基对苯二胺溶液1 滴，阳性呈现粉红色，并且逐渐加深，再加1%α － 萘酚溶液1 滴，阳性于30s 内呈现蓝色，阴性于2 min 内不变色。

3. 2. 2 初筛

针对分离出的菌株，根据肉品发酵剂标准检测菌的耐盐性、产酸能力、产气情况等，筛选对人体无害，具有一定的发酵适应性并且具有抗冷冻干燥特性的优良菌株。

3. 2. 3 复筛

取阴性菌株分离纯化3 次，并在相应的液体培养基中活化3 次，然后接入含500 μg / mL 含6 种生物胺( 色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺) 的对应的液体培养基中， 37℃，30 r /min 摇床培养72 h 后，取1mL 样品，加入0. 4 mol /L 的高氯酸1 mL 后，－ 20℃冰箱中待测。

4.脂肪氧化测定：脂质氧化主要通过测定过氧化值（POV）与TBARS值来进行评价。

过氧化值(Pov)测定：过氧化值测定参照Low和Ng(1978)的方法。称取约1g脂肪，置于 250ml碘量瓶中，加入氯仿:冰乙酸(2:1v/v)混合溶液 25ml，加塞摇动，使其溶解，然后准确加入0.5ml饱和碘化钾溶液，在15-25℃的暗处，静置 5min，避光静置结束，取出加入75ml蒸馏水，摇匀后立即用 0.01mol/L的硫代硫酸钠标准溶液进行滴定，近终点时加入 0.5ml淀粉指示剂，继续滴定并强烈振摇至蓝色消失为止。

过氧化值按如下公式(Eq.2-1-2)进行计算:

过氧化值(meq/kg)=(V1一V2)c/m x1000(Eq.2-1-2)

式中: Vl试样消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL;

V2空白试验消耗的硫代硫酸钠标准溶液体积，mL;

c硫代硫酸钠溶液的标定浓度，mol/L;

m试样的质量，g。

TBARs值测定:按照salih(1987)的方法进行测定。一定量样品解冻，称取5g于80ml离心管中，加25ml20%TCA和20mlH₂O，在冰水浴中用高速匀浆机以3000rmp转速匀浆60秒，静置1小时，然后在2000g、4℃条件下离10min，过滤，滤液用双蒸馏水定容到50ml，然后取 2ml滤液加 2mlTBA(0.02M)在沸水浴中反应 20min，取出用流动水冷却 5min，最后用岛津UV-2450紫外一可见分光光度计测定532nm的吸光度，空白样:25ml20%TCA用双蒸馏水定容到50ml，然后取2ml滤液加 2mlTBA。TBARs值通过标准曲线来计算，结果表示为mg丙二醛(MDA)/kg肌肉。

5. 生物胺检测

5.1 标准溶液配制与柱前衍生

参照卢士玲[15]方法并稍作修改。配制终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/ml的混合标准溶液。取1 mL的标准品混合溶液，加入200μL 2N NaOH使之呈碱性，再加入300μL饱和NaHCO3 溶液进行缓冲，然后再加入2mL的Dns-Cl溶液（10 mg/mL溶于丙酮），在40℃下黑暗中反应45min,然后加入100 μL的25%的氨水以中止反应，静置30min后用乙腈定容至5 mL。然后用0.22 μm的滤膜过滤，用于分析检测。

5.2 样品处理

取5g绞碎后的鱼肉加入20mL 0.4mol/L 的高氯酸（HClO4），匀浆机上彻底匀浆，然后于超声波提取仪中超生提取30 min，冷冻离心机（4℃，3000rpm）离心10min，沉淀部分如前述的方法再提取一遍。取两次的上清液用0.4mol/L 的高氯酸（HClO4）定容至50mL。取1mL 的样液如标准溶液方法进行柱前衍生。

5.3 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6250mm2，5μ m)，流速为 1 mL min－1，紫外检测波长为254 nm，进样量20 μL，柱温30℃，流动相A为水，B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序

Table 2 Gradient elution program

可行性分析：

所在实验室具有相关领域的研究基础，对于传统发酵肉制品中生物胺、脂质氧化的研究技术已经比较成熟。对于干腌培根也有过一定程度的研究，可以方便的获取前人经验以及第一手资料，减少实验设计上的失误，对实验的顺利进行具有很大的借鉴意义。

4. 研究创新点

1.比较多酚类植物提取物（茶多酚、葡萄籽提取物和姜辣素)和VE(对照)对干腌培根的抑菌效果，从而控制产胺微生物繁殖，达到控制生物胺积累的目的。同时多酚类植物提取物具有较强的抗氧化性，可以减弱脂质氧化作用，防止脂肪过度氧化，此实验方法可起到一举两得的效果。

2. 分离鉴定干腌培根中产氨基酸脱羧酶微生物及产生物胺氧化酶微生物，研究不同培养条件下(温度、pH、添加物等)产胺微生物及产生物胺氧化酶微生物产酶特性，从微生物层面来揭示生物胺积累机理。

5. 研究计划与进展

2013年12月，对实验材料等进行了初步准备

2014年2月4月中下旬进行毕业设计实验部分

2014年4月底5月底进行毕业论文的撰写，修改。