1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
病原微生物侵染果蝇后,会进行一系列的隐瞒或者调整,以确保它们能够在宿主果蝇的免疫反应下继续生存下去[1,2]。昆虫病原线虫共生菌菌株s1是一种强有力的昆虫病原细菌,它能够快速的引起宿主果蝇表达出分子产物进行免疫反应,而这,对于我们来说,则是一个探索免疫的分子基础的一个有用工具。在侵染过程中,s1能够在昆虫中迅速繁殖,并且产生出一系列的毒素,抑制宿主果蝇的免疫吞噬,其结果是,最终杀死宿主果蝇[1]。
近些年,国外有多个实验室都在进行这个方面的研究,主要的细菌为photorhabdus,photorhabdus是能够引起果蝇免疫反应的一类共生菌,对于photorhabdus中的各种细菌引起的免疫反应,国内外实验室研究的都比较透彻,已经被建立成为研究果蝇免疫识别和防御机制的工具[1,3]。
s1菌株属于serratia nematodiphila的一个菌株,serratia nematodiphila在分类上属于enterobacteriaceae科,serratia属,与heterorhabditidoides chongmingensis线虫共生,而与这一线虫共生的serratia属的细菌还有两种,分别为s.marcescens和s.sakuensis,这两种对于果蝇免疫机制的影响已经基本清楚了。s.nematodiphila与前两种的不同在表型特征上就有不同,比如精氨酸水解酶活性就有明显不同,在碳源的选择上也有很多不同【5】。
2. 研究的基本内容和问题
果蝇imd信号途径两种突变体被病原线虫共生菌菌株s1侵染时,两种突变体的免疫系统定会产生免疫反应,而产生了什么样的免疫反应,其免疫机制就是我们本次课题所要研究的目标,而主要的现象则是观察在细菌侵染的情况下,野生型果蝇和两种突变体的果蝇型的死亡率的不同。
本次课题的关键问题在于实验过程中的防污染问题。有研究课题就可以知道,研究的对象细菌是s1菌株,而果蝇在试验中,也是很容易就能够被其他细菌污染的,所以在实验中,不管是在那一个步骤,都需要防细菌的污染,避免杂菌对实验数据造成干扰,所需要用到的一些列器具都应该在消毒杀菌之后才能够进行使用。
还有一点,便是果蝇的培养。因为试验中需要用到大量的果蝇,所以需要大量的扩繁,在一定量的情况下,才能够有效的避免个体果蝇的不同对实验结果的影响。
3. 研究的方法与方案
1、果蝇的培养。果蝇的成功培养是后面一切实验的前提,实验室中的果蝇培养方法已经是很成熟的了,培养方法不会成为影响因素,唯一一点就是,要大量培养果蝇,需要一段比较长的时间。
2、细菌的培养。配置lb固体培养基,高压灭菌之后倒平板划线,然后挑选单菌落到消毒灭菌之后的lb液体培养基中进行摇菌培养细菌,隔夜培养细菌,第二天将隔夜培养的细菌稀释,到od(600nm)=0.15,备用,其余细菌保种,留待下次再用。
3、细菌侵染。实验室中细菌侵染方法主要有两种,一种为针刺法,另外一种为喂养法,因为针刺法不好操作,需要花很多时间练习,所以本次课题采用的是喂养法,使用混有上述稀释过的细菌的蔗糖溶液培养果蝇,当然了,试验中分为实验组和对照组,每隔一段时间观察一次。
4. 研究创新点
S1菌株侵染果蝇的研究项目是一个全新的研究项目,在国内外的实验论文中都还没有过这一方面的研究报告,所以说,就是在课题的研究上,这已经是一个全新型的创新课题,同时,利用表观的存活比来推断免疫机制,也是一种从表观到分子层面的认识,这也是本实验的一个特色之处!
5. 研究计划与进展
首先,花费差不多一个月的时间,对果蝇进行培养。查资料可以知道,果蝇大约是在十四天左右才能够从幼虫长到成虫,所以,一个月的时间差不多能够培养两轮的果蝇,使得可用果蝇大概达到六十只左右(已经完成)。
其次,花3-4天的时间培养细菌,涉及到lb培养基的配置、各种实验器具的消毒等,所以四天的时间差不多够用(正在进行中)。
然后,果蝇的侵染。三天左右的时间,每隔六小时,记录一次各管果蝇的存活率,进行比较,分析实验现象的原因。
