1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
物质转运是细胞最基本的功能之一，生物体通常具有多种转运蛋白家族以控制物质在细胞外的运输、装载与细胞内的转运、贮存。天然抗性相关巨噬细胞蛋白（natural resistance-associated macrophage protein，nramp）家族，是广泛存在于生物界的一类质子偶联的离子转运蛋白，在进化上相当保守。nramp家族作为离子载体蛋白的重要组成部分，在吸收、转运二价离子领域起作用。许多二价离子都具有相当重要的生理生化意义，如二价铁离子在生物体内参与铁硫蛋白、铁卟啉等关联呼吸链相关物质的组成，在电子传递方面具有极其重要的意义；锰离子作为许多酶的辅因子与激活剂，对生物体内激活并实现酶的功能有着不可替代的作用。
由于nramp家族在生物体内承担着十分重要的角色，因此在进化上十分保守，一般选用哺乳动物的nramp基因为基准，构建进化树以及完成同源对比。哺乳动物的nramp1基因和nramp2基因有66%的同源性，与从酵母体内分离的nramp家族同源基因smf1和smf2具有40%以上的同源序列，与水稻体内分离的osnramp1具有40%以上的同源性，属于比较保守的类群。各种生物的nramp家族蛋白在功能上却存在一定差异，这主要是由于不同生物对无机元素的需求种类与需求量不同，从而导致了不同生物体内同源、同工蛋白存在差异，如拟南芥nramp1蛋白（atnramp1）与水稻nramp5蛋白（osnramp5）都为mn转运蛋白，在体外高mn含量刺激时，atnramp1表达量上调而osnramp5表达量几乎无变化，这其中的差异在分子水平的原因是由于二者对mn的亲和性不同。atnramp1吸收mn的km值为28 nm而osnramp5为1.08 mm，更低的km值意味着对mn更高的亲和性，因此在高浓度mn刺激下atnramp1更容易上调表达量。这反映了由于进化导致了生物在分子水平产生了分歧以适应不同的环境与内在生理需求。
国内外许多实验室对nramp家族给予高度重视，在植物领域已将如水稻、拟南芥、油菜等多种物种的基因及蛋白序列共享至网络数据库实时更新。在此基础上，各国科学家利用水稻、拟南芥为主要材料，进行nramp家族的各个成员蛋白相关生理生化功能的研究，确定了部分nramp家族的各个成员蛋白的功能以及性质，同时对各个物种的nramp家族基因进行生物信息学分析，已经完成初步的分子进化树构建，对于nramp家族的分子起源与同源性有了一定的认识。在农业领域，已经找到针对于水稻、拟南芥等植物吸收镉、锰等重金属元素的相关nramp家族基因，引发了许多科学家对于该基因进行敲除实验，在实验室得到了对农业具有重要价值的低吸收镉植物，这对于未来农业生产和环境修复有着非常重要的意义。
2. 研究的基本内容和问题
1.对油菜中的nramp家族基因提取、分离与鉴定
2.对于所提取的目的基因在油菜体内的表达水平，产物类型进行初步鉴定。初步确定产物功能与性质，并分析相关生理学意义。
3.确定油菜中的nramp家族基因的亚细胞定位以及组织分布，并分析其差异，解释相关生理与分子水平的原因。
3. 研究的方法与方案
实验主要路线是：获取油菜基因组——设计引物完成目的基因体外扩增——重组质粒导入酵母验证功能——利用GFP标记目的基因——观察被GFP标记的重组植物的荧光分布。
首先在NCBI等数据库（油菜基因数据主要收录于欧洲的Ensembl数据库中）中找到油菜NRAMP家族基因基因序列，利用相关软件分析其基因序列，设计目的基因的引物对若干组，并设计pcr的程序以及pcr试剂中pcr模板、引物等配比。在提取油菜基因后，按照相应的pcr程序完成油菜NRAMP家族基因基因的体外扩增。对目的NRAMP基因序列进行扩增之后，将目的基因片段插入至合适的穿梭载体中，转移至酵母细胞内进行扩增，将酵母菌转化子培养在不同的高浓度重金属离子培养基中，以鉴定该基因的功能。在确定目的蛋白功能的基础上，可利用绿色荧光蛋白（GFP）基因和目的基因构成的重组质粒，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，在相应的重金属培养基上，再生出转基因植株。此时的植株所表达的目的蛋白被GFP所标记，在植株培养到合适的阶段可利用荧光显微镜等技术来观察目的蛋白的组织分布。在设置空白对照后可观察由于施加重金属刺激，从而导致目的蛋白表达量的变化。论文的生物信息学部分可通过实验结果与论文数据库中的相关论文内容进行横向比对。
该实验难度中等，其主要难点在于目的基因的获取和相关功能的鉴定。前者由于pcr所需引物理论上有许多组，但适合于体外扩增的引物对，则比较难以确定，需要反复试验以确定在温度、容错率、产量等方面比较合适的引物对，从而开展置信度以及效率较高的实验。比较容易出现的问题则是扩不出来或者是由于这22个蛋白的同源性较高，从而导致所扩增的片段并非目的基因所在的片段，即特异性不高。后者则是难以确定实验所需的离子浓度范围，超过该蛋白作用的合适的离子浓度范围则有可能使得实验难以继续，造成这种现象的主要原因是不同物种，或同物种NRAMP家族中不同成员的蛋白对于离子浓度的灵敏度（Km值）有差异。上述主要问题可以通过多次试验以确定较为合适的稳定的结果。
4. 研究创新点
国内外尚缺乏对于油菜NRAMP家族基因功能的具体研究，对于其在油菜体内的表达量、转运离子类型、转运离子方向、转运蛋白Km值、植物体内亚细胞定位、组织分布以及与水稻拟南芥等已有报道的物种二者之间的差异等等问题缺乏一定的报道。在此基础上开展对于油菜NRAMP家族基因的研究，有利于阐明相关植物的生理习性、完善农作物生理指标的资料库，有利于研发耐锌镉等重金属元素的新型农作物，对于接下来的油菜NRAMP家族基因研究有一定作用，对未来水稻等植物的相关研究有一定的启发，对于保护环境、提高农作物产量、降低污染的可持续新型农业有着巨大的推动作用。
5. 研究计划与进展
原定的实验计划是在2020年4月左右完成NRAMP家族蛋白在酵母体内的功能验证，5月完成NRAMP家族蛋白在拟南芥体内的亚细胞定位和组织分布的荧光观察实验，6月份完成实验与论文并提交答辩，现由于疫情影响，适当向后延迟实验，具体实验进展视情况决定。
