1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
粘细菌是一类具有复杂多细胞行为的革兰氏阴性杆菌[1],能够产生丰富的生物活性物质。由于其种类多，结构新、作用机理新颖多样的特性，被公认为继放线菌后的又一重要药源微生物新类群[2-3]。粘细菌的次级代谢活性物质在医疗、生态、农业、工业上均有应用价值，因此，粘细菌中生物活性物的资源开发和研究具有重要的意义。本研究对粘细菌中克隆得到的外切葡聚糖酶基因进行研究，丰富了糖苷水解酶的资源，也为粘细菌中糖苷水解酶的研究奠定了基础。
生防菌可以产生生物活性物质抵抗植物病原真菌，抗菌蛋白作为一类主要的抗菌成分受到国内外专家的关注，目前抗菌蛋白的主要作用机理之一是破坏细胞壁[4]，如粘细菌可以降解绿藻(cladophora),破坏真菌的细胞壁,降解rhizoctonia solani的菌丝和cochliobolus miya-beanus的分生孢子等[5]。粘细菌次级代谢产物的抗真菌活性报道较多[6]，第一个在粘细菌中被确定化学结构的抗真菌活性物质是ambruticin[7],通过干扰糖类代谢抑制能量产生和传递发挥高效抑制真菌作用。
葡聚糖酶是对真菌产生抑制作用的主要酶类之一[8]。如β-1,3-葡聚糖酶作为一种重要的病程相关蛋白，可以降解作为大多数病原真菌细胞壁主要成分之一的β-1,3-葡聚糖，裂解病原真菌细胞壁导致病原菌死亡[9]。本实验室保存一株具有良好抗真菌能力的粘细菌egb，实验室研究人员前期研究表明珊瑚球菌egb的抗真菌能力主要是通过分泌一种β-1,6-葡聚糖glum裂解真菌细胞壁来实现的[10],由于β-1,6-葡聚糖是真菌细胞壁中重要的交联结构 ，β-1,6-葡聚糖glum可以专一的水解β-1,6-葡聚糖，从而破坏细胞壁达到抗菌效果。为了进一步了解并丰富粘细菌egb中的糖苷水解酶资源，以期望其能够成功应用于农业生产中，本研究以corallococcussp. egb为出发菌株，克隆得到外切葡聚糖酶基因，并成功在大肠杆菌bl21中进行表达。经过对该蛋白分离纯化及初步酶学性质研究，结果表明该外切葡聚糖酶是一类同时能够水解β-1,3、β-1,4和β-1,6糖苷键的多功能酶。同时，经过蛋白序列比对及结构域预测分析发现该蛋白同时具有2个duf4082，1个duf11和一个fascin 3结构域，而与同类型的多功能水解酶相比，结构上有较大差异，因而具有重要的研究价值。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过对珊瑚球菌egb来源的外切葡聚糖苷酶基因的克隆表达和蛋白纯化，对其酶学性质进行初步分析，丰富新型糖苷水解酶资源。
研究内容：以corallococcussp.egb菌株为材料，提取基因组，扩增目的蛋白基因，在大肠杆菌bl21中进行表达并纯化，进而对酶学性质进行研究。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1外切葡聚糖酶基因的克隆
利用本实验室保存的珊瑚球菌egb菌株进行基因组dna的提取。用引物设计软件进行引物设计，以基因组dna为模板进行pcr扩增。pcr反应体系（50μl）如下：2×phanta max buffer25.0μl、dntp mix1.0μl、5817-f2.0μl、5817-r2.0μl、模版dna1.0μl、phanta max super-fidelity dna polymerase1.0μl、无菌ddh2o 18.0μl。
4. 研究创新点
粘细菌可以分泌多种对真菌细胞壁具有降解作用的糖苷水解酶，如本实验室研究人员前期研究表明珊瑚球菌EGB的抗真菌能力主要是通过分泌一种β-1,6-葡聚糖水解酶活性的蛋白GluM裂解真菌细胞壁来实现的。
实验初期经过对该蛋白分离纯化及初步酶学性质研究，结果表明该外切葡聚糖酶是一类同时能够水解β-1,3、β-1,4和β-1,6糖苷键的多功能酶。同时，经过蛋白序列比对及结构域预测分析发现该蛋白同时具有2个DUF4082，1个DUF11和一个Fascin 3结构域，而与同类型的多功能水解酶相比，结构上有较大差异，具有重要的研究价值。因此实验通过珊瑚球菌EGB来源的外切葡聚糖酶基因的克隆表达与蛋白纯化进一步丰富粘细菌EGB中的糖苷水解酶资源，并且为粘细菌在真菌生物防治方面的开发应用提供了理论基础。5. 研究计划与进展
2019.09-2019.10阅读文献，撰写文献综述，了解实验理论基础及方法
2019.10-2019.11外切葡聚糖酶基因的克隆、重组表达质粒的构建、目的基因和pet29a载体的重组反应、大肠杆菌的转化与筛选
2019.11-2020.01重组大肠杆菌的诱导表达、重组蛋白的sds-page分析、外切葡聚糖酶水解活力和蛋白浓度的测定
