1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
由于卤代芳烃化合物具有难降解、高毒性等热点，很多被列为“持久性有机污染物”（persistent organic pollutants, pops）和“优先控制污染物”（priority pollutants）[1, 2]。为了适应卤代芳烃的毒性环境，细菌进化出了多种类型的卤代芳烃代谢途径[3, 4]：一方面通过代谢解除卤代芳烃的毒性；另一方面卤代芳烃可为细菌生长提供碳源和能源。学术界关于卤代芳烃的微生物降解研究报道很多，阐明了多种类型的卤代芳烃微生物代谢途径、代谢基因和酶学催化机制[5, 6]。然而，关于卤代芳烃微生物代谢的调控机制研究很少，调控机制种类报道不多。因此，研究微生物对卤代芳烃的代谢调控机制具有重要的科学意义。
目前国内外对卤代芳烃代谢调控机理的文献较少，主要聚焦于转录因子与启动子的作用方式以及各类转录调控因子的作用机制。细菌中的转录调控因子主要有lysr、iclr、gntr、 arac/xyls、 marr/slya、 xylr/ntrc和 fnr等家族，这些转录调控因子在芳香族化合物代谢中起到重要作用。lysr家族调控因子（lttr）是原核生物中最常见的转录调控因子，在古生菌和真核生物中发现了相同功能的蛋白[1]。例如cbnr调控cbnabcd激活氯邻苯二酚代谢[7]，在菌株comamonastestosteroni t-2 中tsar调控tsambcd降解甲苯磺酸盐[8]，在菌株pseudomonas pseudoalcaligenes kf707中bphr2调控联苯分解代谢基因簇的转录[9]，在菌株sphingomonaspaucimobilis ut26中lind和line在底物2,5-二氯对苯二酚（2,5-dchq）和氯对苯二酚（chq）存在下诱导表达，表达的产物可以降解γ-六氯环己烷[10]。在菌株 burkholderiasp.th2中 cbds参与 2-氯苯甲酸降解基因簇 cbdabc的转录调控[11]。然而，关于marr家族的调控元件参与的卤代芳烃的代谢调控研究报道极少。根据已有的研究发现，marr家族蛋白参与调控污染物降解时，通常以阻遏蛋白形式存在，marr同系物与基因结合通常抑制两种基因的转录，当诱导物与蛋白结合，蛋白构型发生变化失去与dna结合能力，解除阻遏，从而启动基因的转录表达[12]
本研究前期从菌株 pigmentiphagasp.h8中揭示了 3-溴-4-羟基苯甲酸（bhb）的代谢途径，即首先通过4-羟基苯甲酸羟化酶phbh2将bhb转化为3-溴-4,5-二羟基苯甲酸，随后被原儿茶酸双加氧酶pcaa2b2开环降解。我们发现，bhb的代谢基因簇phbh1pcaa2b2上游存在一个marr家族的调控元件基因orfr2，且phbh1pcaa2b2的转录表达是诱导型的，因此，我们推测调控元件基因orfr2参与bhb代谢基因簇phbh1pcaa2b2的转录调控。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
本研究以菌株 pigmentiphagasp.h8中3-溴-4-羟基苯甲酸（bhb）代谢簇phbh2pcaa2b2的转录调控元件基因orfr2为研究对象，通过鉴定转录调控元件基因orfr2的功能，鉴定转录调控单元、转录起始位点和转录调控的效应物，揭示调控元件的四级结构以及与启动子的结合位点，最终阐明orfr2对3-溴-4-羟基苯甲酸降解基因簇phbh2pcaa2b2的转录调控机制。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）转录调控因子orfr2的功能验证
采用基因敲除和互补的方法来研究orfr2的功能。首先敲除原始菌株h8中的orfr2基因（利用阴性菌接合转移型质粒和sacb反向筛选标记进行基因插入失活），获得orfr2缺陷型菌株。然后借助广宿主载体pbbr1mcs-2将orfr2互补至缺陷型菌株中，获得orfr2缺陷互补株。分别检测野生株、缺陷型菌株和缺陷互补株对3-溴-4-羟基苯甲酸的降解情况，并提取三种菌株的mrna，借助荧光定量pcr，检测野生株、缺陷型菌株和缺陷互补株的靶标基因phbh2在转录水平的差异，从而确定orfr2的功能。
4. 研究创新点
目前，学术界关于微生物对卤代芳烃代谢调控机制的研究报道较多，且重要集中在LysR家族的调控元件，而MarR家族的调控元件参与卤代芳烃代谢调控的研究极少，有必要对其展开研究，丰富卤代芳烃代谢调控的理论。
本研究中OrfR2属于MarR家族，因此研究OrfR2调控菌株H8中3-溴-4-羟基苯甲酸（BHB）代谢簇phbh2pcaA2b2的转录具有重要意义。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2019年10月-2019年12月：证实了marr家族的调控元件orfr2参与3-溴-4-羟基苯甲酸代谢簇phbh2pcaa2b2的转录调控；鉴定转录激活的效应物；
2020年1月-2020年2月：异源表达并且纯化orfr2；
