1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义：
地下水是地球水环境中极为重要的一环，在水资源循环中，地下水担负着储蓄水源、平衡水资源的任务。与此同时，人类的发展也离不开地下水，地下水为我们人类生存提供饮用水资源，为人类的工业、农业以及畜牧业的发展提供使用水源。可以说，地下水资源的安全与否，和我们人类的生产、生活息息相关。近年来，地下水污染的形势愈加严峻，地下水污染物种类繁多，氯苯类化合物作为地下水中典型污染物，其检出率高达5.31，毒性较强的一类污染物，已经严重威胁到了人们的饮水安全和生产安全。氯苯类有机物是在我国最新的饮用水标准中，氯苯类有机物的控制种类比旧标准增加了多项，可以说氯苯类有机物的存在与否，直接关系到我们的饮水安全，有机污染物控制及消除刻不容缓。地下水环境中氧气含量低，氯苯类物质密度比水大，可向下迁移至深度厌氧含水层。因此对实际场地修复而言，研究氯苯类物质厌氧微生物降解转化更具有实际意义。因此，探究厌氧微生物对氯苯类污染物的还原脱氯对保护地下水安全具有十分重要意义。
国内外研究概况：
我国地下水资源受污染概况
在2018年，我国生态环境部（原国土资源部）曾对全国地下水水资源的状况进行了全面的调查，结果显示：我国地下水资源的天然补给量每年约为8840亿m3，其含量占到了我国水资源总量的1/3，其中，山地地区拥有6560亿m3，平原地区拥有2280亿m3；我国地下水水资源可开采量每年约为3530亿m3，其中，山地地区占有1970亿m3，平原地区占有1560亿m3。其为我国近70％的人口提供饮用水。从整体分布上上看，我国地下水资源分布南北差异较大。我国南方地下水资源丰富，约占全国地下淡水总量70；而北方相对缺乏，约占全国地下淡水总量的30。综合看来，我国地下水水资源量整体呈现从东部向西部减少的趋势，局部地区分布不均匀。地下水水质状况呈现出西部、南部优于东部和中部地区，主要原因在于农业、工业以及人类生活对地下水环境的污染。
第一次全国性地下水普查结果显示[1]：我国大中城市不同程度地存在地下水污染的状况，其中，南方城市污染状况普遍要于北方城市，松辽平原、华北平原、江汉平原以及长江三角洲等地区的污染较为严重。我国地下水污染的分布概况如下表1所示：
| 地区 | 地下水污染状况 |
| 东北地区 | 东北地区由于重工业和油田开发的原因，其地下水污染形势比较严重。其中，氨氮、亚硝酸盐氮、石油类为松嫩平原的主要污染物来源；下辽河平原的主要污染物则为氨氮、硝酸盐氮、石油类、挥发性酚等。长春、大连、哈尔滨、佳木斯等城市的地下水是严重污染的典型代表。 |
| 华北地区 | 华北地区地下水污染不容乐观，呈现出加重趋势。华北地区由于人类经济活动强烈，不论城市还是农村的地下水都普遍受到污染，地下水总硬度和矿化度超标较为严重，其中太原、北京、呼和浩特等城市的地下水总硬度超标现象非常严重。 |
| 西北地区 | 西北地区地下水污染普遍较轻，原因在于受到人类活动干扰相对较小。陆盆地地区硝酸盐氮污染严重；亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、铬、铅等污染集中在黄河中游、黄土高原地区，以点状、线状的形式分布在城市以及工矿企业周边，典型代表城市为兰州、西安等。 |
| 南方地区 | 南方地区地下水水质整体上比较乐观，但局部地区污染比较严重。西南地区的地下水污染在城镇、乡村居民点间呈现点状分布，污染类型以氨氮、亚硝酸盐氮、锰、铁、挥发性酚等为主，污染程度、污染范围都不大。中南地区污染以亚硝酸盐氮、氨氮、汞、砷等为主，污染程度不高。东南地区地下水总体污染较轻，但个别城市及局部工矿区域的地下水污染较重，尤以珠江三角洲地区、长江三角洲地区为甚。 |
综合看来，我国地下水环境形势依然严峻，地下水污染呈现出由水常规污染向复杂有机物污染的变化趋势。因此，地下水污染防治的范畴也不仅仅在常规水质污染物，而是要向复杂有机污染物发展。氯苯类物质在环境中难以降解，同时具有迁移性，它广泛地分布在环境中。并且具有 POPs 的各种特性，在空气、水体和底泥中的半衰期很长，因此可在环境中持久地存在。更容易在环境中长距离迁移[2]。HCB 能蓄积在食物链中对有较高营养等级的生物造成影响；在相应环境浓度下会对接触该物质的生物造成有害或有毒效应。
氯苯类物质还原脱氯机理
CBs类化合物可通过氧化法发生脱氯降解现象。CBs类化合物的氧化脱氯方法主要有电化学氧化法、光催化氧化法、Fenton试剂氧化法等[3,4]，CBs 氧化过程是由于发生电子得失反应，系统内产生活泼的羟基自由基[·OH]、过氧化氢(H2O2)以及臭氧(O3)等强氧化物质从而降解CBs化合物[5]。由于反应中产生的·OH 缺少合理的分析检测手段，导致大多数的机理研究目前处于猜测和设想阶段。另有研究发现，CBs 化合物也可通过厌氧方式脱氯，且厌氧环境下脱氯效果更佳。根据这一发现，有学者开展了HCB厌氧脱氯的技术研究，结果发现 用厌氧污泥降解HCB的生物转化效率明显提高[6]。台湾大学的Chen等[7]在取自 Ho-Tsin 河流的底泥中加入 HCB，结果也证实了厌氧环境可以促进HCB的脱氯降解; 另有德国学者的研究结果也证实了在被水浸透的土壤厌氧微环境下，20周后HCB的降解率达 99以上[8]。
氯苯类化合物与芳烃类化合物相比。生物降解性大大降低，主要原因是氯苯类化合物有较高的电负性，强烈吸引苯环上的电子，使苯环成为一个疏电子环，因而很难发生亲电反应。随着氯取代基的增多，氯苯类化合物的活性逐次下降。氯苯类化合物降解的关键在于脱氯。根据脱氯过程中电子得失，将氯苯类化合物生物降解分为氧化脱氯和还原脱氯[9]。
好氧生物降解
在好氧条件下，氯苯类化合物的降解反应基本上遵循一种相似的先开环再脱氯的机制[10]。首先在芳环羟基化1,2-双加氧酶作用下，在芳环中插入氧原子，形成相应的环状氯代二醇，再在去氢酶作用下，脱除两个氢原子转化为相应的氯代邻二酚。研究表明，好氧生物体中不仅含有1,2-双加氧酶，而且还含有可使苯环发生邻位裂解的酶。该酶可催化氯代邻二酚邻位开环，生成相应的氯代粘康酸，此产物在内酯化过程中脱除氯原子并被氧化成氯代马来酰基乙酸，最终进入三羧酸循环。氯苯类化合物的氧化脱氯还存在一种较少见的先脱氯后开环再脱氯的催化反应体系，即在单加氧酶作用下，由羟基取代氯原子，再经过单加氧酶的进一步作用，形成开环裂解的中间体氯代邻二酚，才能进一步降解[11]。
厌氧生物降解
氯苯类的厌氧生物降解机制主要是在酶催化作用下由氢取代氯，发生脱氯反应，但脱氯途径可能不是单一的。还原脱氯是指氯苯类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基，并释放出一个氯阴离子的过程。还原脱氯主要发生在厌氧条件下，但在多氯化合物的好氧降解中有时也可能发生。许多在好氧条件下难以降解的有机物在厌氧条件下变得更易降解，这是由于，在厌氧条件下，环境的氧化还原电位较低，氯原子容易被取代，降低这些难降解的有机物毒性，容易被微生物同化。Susarla Sridhar等人分析了厌氧条件下，氯苯上氯原予的去除顺序是：首先脱除在相邻的两个碳原子上都有氯原子的氯原子，然后脱除在相邻碳原子上只有1个碳原子有氯原子的氯原子，最后脱除相邻碳原子上都没有氯原子的氯原子[12]。还原脱氯途径需要多种微生物共同参与，由于微生物之间需要相互作为电子受体和供体，并且彼此依靠消除中间产物，使降解更以进行。BRAHUSHI等[13]研究了耕种土壤中的还原脱氯过程和被C14标记的HCB的降解路径，在这种厌氧环境中的脱氯路径为HCB→五氯苯→1,2,3,5-四氯苯→1,3,5-三氯苯→1,3-二氯苯。美国的Raman等在产甲烷条件下研究六氯苯，1,2,4-三氯苯的降解时，发现六氯苯的降解还存在另外一种降解途径[14]。实验中没有产生1,3,5-三氯苯，也没有其它三氯苯浓度的积累，而是进一步转化为一氯苯，这表明六氯苯、五氯苯的降解机制将多于一种途径。三氯苯的厌氧降解多数情况是混合菌群作用结果，纯菌株的分离一直是难点所在，而只有分离出纯菌株才能明晰三氯苯的还原脱氯过程。2000年Adrian等[15]第一次分离出能够在严格厌氧环境下降解氯苯类化合物的菌株Dehalococcoidessp.CBDBI，它能在氢气共存条件下将l,2,3-TCB、1,2,4-TCB、l,2,3,4-TeCB、1,2,3,5-TeCB和l,2,4,5-TeCB还原脱氯，并能通过“脱氯共呼吸”作用满足其对能量的需求。应用前景：
虽然越来越多的各国研究人员对氯苯类物质的厌氧生物降解进行着研究，也不断地在其降解机制、降解特性、降解影响因素和氯苯类物质厌氧降解菌种等方面取得一定的成果，但是到目前为止，氯苯类物质的厌氧生物降解机理仍未完全清楚、各种环境因素对降解的具体影响仍有待进一步研究。更重要的是，虽然在理论和试验中已经证实氯苯类化合物能够被特定微生物降解，但是将实验室中分离出来的纯菌用于实际环境进行生物修复时，却得不到理想的降解效果。因此，在氯苯的厌氧生物降解研究方面，还有很多的工作值得开展，具有非常高的实际应用价值和市场价值。
2. 研究的基本内容和问题
本研究，首先通过查阅大量文献，对地下水中氯苯类有机物种类、浓度进行了汇总分析；选择特征氯代物1,2,4-tcb作为目标污染物，进行实验探究其厌氧脱氯途径及厌氧降解功能菌和其生物群落结构。具体研究包含以下三个方面：
研究内容一：地下水中特征氯代物调查
通过阅读大量的文献，将前人的研究结果进行了分析，对地下水中的氯代有机物种类以及浓度进行了汇总，并参照最新国家饮用水标准的规定，对其毒性进行进行了调查。然后确定出特征氯代物作为目标污染物进行实验研究，主要分析地下水中氯苯类污染物厌氧微生物还原脱氯机制。
3. 研究的方法与方案
1.厌氧降解菌株的富集培养：
（1）样品：实验所用水土样取自南京某受氯苯类污染物污染的化工厂，土样取自地面以下 1.5 ~2m 处，储存在离心管内并立即用封口膜和自封袋密封以隔离氧气。地下水样储存在棕色瓶内，装满整个瓶子并用封口膜隔离氧气。所有的样品都保存放置于冰箱中。
（2）主要化学试剂：六氯苯、qcb、1,2,4,5-tecb、1,2,3,5-tecb、1,2,3,4- tecb、1,2,4-tcb和1,3,5-tcb，厌氧指示剂，cbs，实验用水为超纯水。
4. 研究创新点
生物修复在废水处理中的应用范围在逐渐扩大，同时取得了很好的效果。但是，天然水体中氯苯类污染物浓度相对较低，如何让降解菌适应新的环境，而且在降解污染物的过程中，没有有毒的中间产物生成，这些是其是否得到广泛应用的关键。本研究从生理、代谢和遗传角度对氯苯类厌氧降解菌群协同作用机制进行深入研究，使其达最佳生态水平，发挥最大效应，将对降解菌群培养的理论和应用都有巨大的突破。
氯苯类有机物的降解主要在于脱氯，在降解过程中测定其中间产物的种类及浓度，研究菌群结构的变化，确定氯苯类有机物好氧降解途径将对于氯苯类有机物的生物处理提供有力的理论依据，探测表征降解性基因的DNA探针及荧光定量（qPCR）技术等技术能为氯苯类厌氧降解菌的生物修复的理论研究提供有力基础，从而可以确定系统的最优条件、设定投菌日程及投菌量，了解混合菌种中生物修复菌本身对系统改善的贡献。
5. 研究计划与进展
2019年9月-10月：文献查阅，地下水中氯苯类有机物种类、浓度调查
11-12月：厌氧降解菌富集培养，制备厌氧培养基，接种1,2,4-tcb脱氯菌液进行培养。
2020年1月-2月：开题报告撰写
