1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
镉是一种具有蓝白色金属光泽、生物毒性较强的重金属，与汞、铅、铬、砷合称为“五毒元素”[1]。镉及其化合物具有较强的水溶性和脂溶性，耕地土壤的镉污染极易引起作物体内重金属镉的大量积累。过多的镉积累不仅会对植物的生长发育造成不利影响，而且积累在植物可食用部位的镉会通过食物链进入人体内，威胁人体健康。有研究表明，镉在人体肾脏内滞留的半衰期长达 10~30年[2]。镉的吸收和蓄积可引起人体骨骼、心血管、肾脏和生殖等方面的疾病，慢性低水平镉元素摄入会对人类健康产生极大的负面影响[3]。国际癌症研究机构(international agency for research on cancer，iarc)已在 2012 年将镉归为人体Ⅰ类致癌物[4]。
石一珺等研究表明，不同种类农产品中镉的富集系数有很大变化，在粮食作物中，镉的富集系数以玉米最低，水稻最高[5]。与其他粮食作物相比，水稻的镉积累能力较强，是重金属膳食摄入的主要来源，稻谷镉污染严重危害了以大米为主粮的人群的健康。
镉并非植物生长的必需元素，植物中不存在镉金属特异性转运蛋白。但由于镉离子与一些二价阳离子的离子半径相似，且许多二价阳离子的金属转运蛋白底物特异性较低，具有镉离子吸收活性，因此镉离子能通过占用镁离子、锌离子、锰离子等植物生长必需元素的离子通道进入植物体内[6]。非选择性阳离子通道(non-selective cation channel，nsccs)在植物的离子转运和营养物质吸收等方面发挥着重要作用，环境中镉浓度越高，nsccs对植物镉积累量的贡献率越低[7]。因此，有研究指出镉离子与其他阳离子间存在竞争关系和拮抗作用，还推测nsccs贡献率减少的原因可能是由于高浓度镉提高了其竞争其他离子通道的能力[8]。镉除了可以自由态二价离子的形式进入根细胞外，还可与植物螯合肽(phytochelatin，pc)等小分子化合物螯合，以cd-pc等结合态形式进入根细胞内，这不仅可以防止镉与功能蛋白（或酶）结合，避免细胞质中各种正常生理活动发生紊乱，还可促进镉从细胞质转到液泡中，降低游离镉在细胞质中的浓度[9]。目前，有研究表明，植物根系吸收的大部分镉会通过液泡的区室化作用积累在根部或直接通过根表皮细胞上的转运蛋白排出根外，只有少部分镉会向地上部转运[10]。
2. 研究的基本内容和问题
本课题运用酵母单杂交的技术，筛选出水稻基因osnramp5上游的转录调节因子，从而对水稻中镉的吸收和转运机制有一个更加清晰的了解。
本研究中， 将osnramp5基因启动子进行序列分析，得到的顺式作用元件连接到pbait-abai 载体质粒上, 转化酵母细胞构建bait-reporter诱饵菌株。构建水稻(oryza sativa)酵母单杂交文库cdna表达载体, 再共转化诱饵菌株, 经文库筛选osnramp5上游转录因子，并通过pcr克隆转录因子序列送公司测序鉴定。
实验中遇到的关键性问题是，在酵母中筛选转录因子是利用外源体系的验证，对于筛选结果的可靠性还需要通过其他互作实验验证，或者在水稻中进行功能验证。
3. 研究的方法与方案
研究方法
酵母单杂交(yeastone-hybrid)最早是1993年由酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析dna与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。酵母单杂交是根据dna结合蛋白(即转录因子)与dna顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cdna)的有效方法。
其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的dna结合区(dna-binding domain, bd)和转录激活区(activation domain, ad)组成，因此可构建各种基因与ad的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。
4. 研究创新点
OsNramp5基因在水稻对镉的吸收和转运中起到了很重要的作用，但是其内在转录调控机制尚未被阐明。运用酵母单杂交方法筛选出OsNramp5基因上游的转录因子，可以更好的了解转录的过程，从而更加明确OsNramp5基因表达的OsNramp5蛋白作用机理，对阐明其内在转运机制也起到了一定的作用。
研究过程中涉及到的环境因(温度，摇床的摇速等)和酵母转化的方法都进行了改进和细化。
5. 研究计划与进展
实验时间是2019.09—2020.06，周期为十个月。预期在实验结束时可以筛选出osnramp5启动子上游的转录调节因子。
2019.09-2019.10：熟悉实验室，对目的基因启动子进行序列分析。预期可从序列分析中获得该启动子的顺式作用元件，用于构建载体。
2019.10-2019.11：构建酵母报道子。预期载体构建成功。
