1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题的意义
锌(zn)是所有生物必需的微量营养素，在植物中，锌是许多酶的组成成分，对蛋白质合成、碳水化合物代谢、细胞分裂、基因表达等过程具有重要作用，锌是许多酶的组成成分和活化剂［1］。此外，锌还能提高植物的抗逆性，当水稻处于涝、旱、盐、冷等不良环境时，体内活性氧会增加，破坏细胞膜透性，降低植物的抵抗能力，而锌能维持细胞膜的完整，避免蛋白质和膜脂被过氧化［2］。
缺锌土壤在全球范围内普遍存在，特别是在非洲和亚洲的大部分地区，影响了作物的产量和营养质量[3]。植物缺锌时常常出现植株矮小、生长缓慢。同时，锌也与人体健康密切相关，缺锌会使人体生长发育迟缓、免疫力低下、生殖功能下降，产生智力障碍，甚至出现不孕等一系列疾病［4-5］。锌缺乏症的风险估计影响了世界上约三分之一的人口，它可以导致不同程度的生长迟缓，免疫功能障碍和认知障碍[6]。因而提高食物中的锌含量至关重要。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在许多地区，水稻作为主食养活了全球近一半的人口，尤其是亚洲人口，但却无法提供足够的人体所需的矿物质营养素[7-8]。全球约50%的谷物产区土壤有效锌缺乏，由土壤缺锌引起的稻米锌含量低又将导致人体缺锌普遍［9-10］。同时，水稻也是对微量营养元素锌敏感的作物，水稻籽粒中锌含量的轻微增加即可有效改善人体锌素营养状况[11]。提高水稻籽粒中微量元素含量对改善本地区人体微量元素营养具有重要意义。有研究表明，水稻籽粒微量元素含量存在显著的基因型差异[12-13]。提高作物食用部分的锌利用效率和锌的积累，构成了解决这些全球性问题的植物性解决方案[14-15]。因此，了解水稻锌营养，对提高水稻产量和籽粒锌含量具有重要意义。
2. 研究的基本内容和问题
目标
使用crispr/cas9技术和rna干扰技术,获得水稻osfbo1基因的三个突变类型的株系。
3. 研究的方法与方案
研究方法
使用CRISPR/Cas9技术,获得水稻OsFBO1基因的三个突变类型的株系。CRISPR指的是一种适应性免疫系统，其产生于细菌和古细菌，它们为了应对病毒的攻击而逐渐进化，产生了这种系统，在CRISPR作用之下，可以检测到病毒的DNA并将其消灭，该机制中，Cas9是一种蛋白质，作用是寻找并切断病毒的DNA，使其降解，crRNA与tracrRNA会结合形成一种复合物，该复合物能特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在定位点将双链DNA剪断，然后其非同源末端与修复机制相连接，将重新连上断裂处的基因组DNA，精准插入特定的DNA片段。同时RNA干扰技术是目前比较有效地抑制基因表达的方法之一，是发生在真核生物细胞中由双链RNA介导的特异性基因沉默现象，在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达．
技术路线
实验方案
CRISPR-Cas9 载体构建 （载体：pC1300-Ubi-Cas9-skm）
一、 设计相关gRNA
1、下载基因全序列以及外显子序列；
2、搜索基因内含子、外显子信息；找到所有的“class0.0/1.0”等级的 gRNA;
3、对 gRNA与基因外显子进行序列比对，找到符合要求的 RNA（满足条件：（1）进行比对的 gRNA 必须位于外显子；（2）设计的 gRNA 应该靠近基因 5’端；（3）一个基因设计 2-3 个 gRNA）；
4、设计引物
二、酶切质粒 Aar I酶切1. 挑单克隆（pC1300-Ubi-Cas9(Kan)）在加有抗生素的 LB 培养基中 37 ℃ 摇菌过夜 (摇 10 mL 左右);
2. 提质粒
3. Aar I 酶切质粒，37 ℃酶切 4-6 h；
4. 酶切产物回收。
三、引物退火
| Forward oligo(50 μM) | 2 μL |
| Reverse oligo(50 μM) | 2 μL |
| 10× T4 DNAligase Buffer | 1 μL |
程序：95 ℃ 30 s → 72 ℃ 2 min → 37℃ 2 min → 25 ℃ 2 min →冰上
四、T4 连接酶连接
| Aar I digestedvector | n μL (~50 ng) |
| Oligo-duplex(diluted) | 2 μL |
| 10× T4 DNAligase Buffer | 1 μL |
| T4 ligase (NEB) | 2 μL |
| add ddH2O to | 10 μL |
程序：25 ℃ 0.5-1 h 或 4 ℃过夜
五、转化 DH5α
六、挑单克隆做菌落 PCR 鉴定
利用设计的 gRNA 引物与 pC1300-Ubi-Cas9 两对引物（F/F or R/R）进行鉴定。
注：菌落 PCR 时要加 1/1000 没有酶切的质粒做阴性对照（必须）
七、测序验证 选取2-3个阳性菌落摇菌提质粒进行测序。
八、质粒转化农杆菌 EHA105
RNAi载体的构建（载体：LH-FAD1390RNAi干扰载体）
一.选取200-400bp长度的目标基因
二.酶切载体
三.将目标基因的序列的正向插入到KpnⅠ-SacⅠ之间
四．将目标基因反向插入到PstⅠ-BamHⅠ之间。转录出相应的RNA后与植物体内产生的RNA形成双链从而在细胞中被降解而达到基因沉默的目的。
说明：在构这个载体是要利用Blast将基因的片段选中，即选择不干扰其他基因的片段，能干扰自己的基因片段。
五、转化大肠杆菌DH5α
六、挑单克隆做菌落 PCR 鉴定
注：菌落 PCR 时要加 1/1000 没有酶切的质粒做阴性对照。
七、测序验证 选取2-3个阳性菌落摇菌提质粒进行测序。
八、质粒转化农杆菌 EHA105
水稻遗传转化
一、诱导愈伤组织 （3-4周）
二、愈伤组织和农杆菌的准备（3-7天）
三、清洗感染的愈伤，筛选抗性愈伤组织 (3-4周)
四、再分化（3-4周）
五、生根（1-2周）
将生长到 3 - 4 cm 的转化植株转移到 MS-HF 培养基上，诱导生根。
转基因材料鉴定
验证获得的植株是否是目标基因敲除材料
可行性分析
F-box蛋白在植物体内的作用相当广泛，与其组成型表达的特征关系密切。蛋白质互作显示水稻OsFBO1基因功能与水稻锌稳态相关，为进一步研究提供了方向。CRISPR/Cas9技术和RNAi是比较方便的基因编辑技术，技术比较成熟。利用基因编辑技术构建水稻OsFBO1基因转基因株系是可行的。
4. 研究创新点
特色或创新之处
使用两种基因编辑方法
构建单突和双突转基因载体
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2019年9月 开始构建转基因材料
2020年3月 培育构建完成的转基因植株
