1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 、研究意义
microrna（mirna）是一类内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链rna分子，通过抑制其靶基因的表达发挥重要的生物学功能。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirna也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirna的组合来精细调控某个基因的表达。已经发现，mirna调节人类1/3基因的表达，参与生命过程一系列的重要进程，包括早期发育以及细胞增殖、分化、凋亡、死亡和脂肪代谢等[1]。据推测，在人类基因组中应有超1000种mirna[2]。mir-124是一种高度保守的mirna，从低等的秀丽线虫到高等的人类均有表达[3]，富含神经元并在人体神经系统中发挥多种作用，参与神经细胞分化的调控过程[4]，具有重要的生物学意义。鉴定mir-124的靶基因有利于对其作用机制和功能发挥的研究。
mir-124在分化和成熟的神经元中高表达，但在神经干细胞、神经前体细胞和胶质细胞内表达很低，它是哺乳动物神经系统内表达最多的mirna，占哺乳动物大脑皮质总mirna的5%～48%[5]，可见其对神经系统的重要性。通过对神经相关的靶基因进一步研究，揭示mir-124对其的调控机制，从而进一步了解mir-124在中枢神经系统及相关疾病中的作用。生物信息分析表明，mir-124可能存在大量的靶基因。mir-124的靶基因参与了转录调控、细胞运输、信号转导等多种重要的生命活动过程，mir-124 在动物中起着重要作用[6]。mir-124在多细胞动物的脑中特异表达，参与神经细胞分化的调控过程[6]。同时mir-124在诸多恶性肿瘤中也起到抑制肿瘤细胞生长的作用，靶点涉及到stat3、tnf- α、lamb1、sphk1、ezh2、rock1、tgf- α、flot1、rac1、rock1 等[7]，mir-124 有望成为恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。由此可见，研究mir-124的靶基因意义非凡。
2. 研究的基本内容和问题
1、研究目的
在哺乳动物中枢神经系统中，mir-124的含量具有绝对优势。研究表明，mir-124在小鼠中枢神经系统的含量是其他器官的100多倍，其中大脑皮质的含量最高，小脑次之(是大脑皮质的60.7%)，脊髓最低(是大脑皮质的35.4%)。mir-124的分布特点决定了其在中枢神经系统中的重要作用。通过对mir-124与神经相关的靶基因进一步研究，揭示mir-124在中枢神经系统的作用机制。
2、研究内容
3. 研究的方法与方案
1、研究方法
使用最常用的mirna靶基因预测软件targetscan预测mir-124靶基因。根据基因的功能筛选神经相关的靶基因。将每个靶基因预测的mre及侧翼序列（500nt）克隆到萤火虫荧光素酶基因的3’utr,从而构建一个报告基因。采用双荧光素酶报告基因法验证预测的靶基因。按照文献报道[40]使用lipofectamine2000瞬时转染萤火虫荧光素酶报告基因质粒，海肾(renilla)荧光素酶质粒和阴性对照质粒或mir-124表达质粒到293t细胞里。36小时后，裂解细胞，用promega双荧光素酶试剂盒测定荧光素酶活性。海肾荧光素酶用于对比细胞的转染效率。报告基因的表达e=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。e0是阴性对照rna转染下报告基因的表达,e1是mir-124转染后报告基因的表达,e1/e0的比值则表示mirna对报告基因表达的影响。如果e1/e0不小于1，则认为软件预测的靶基因是错的。如果e1/e0小于1, 那么mirna有抑制作用，相应的基因即为靶基因；e1/e0的比值越低，mirna的抑制效果就越强。对每一个预测的靶基因，我们用24孔板在293t细胞各进行至少三次转染实验，以从统计学上判断e1/e0是否小于1，即是否为靶基因。
为进一步鉴定mir-124靶基因，使用lipofectamine 2000将阴性对照rna或mir-124 mimics瞬时转染到293t、sk-n-sh和sh-sy5y细胞。48小时后，收集细胞提取总rna和总蛋白。将提取的总rna反转录成cdna，通过实时荧光定量pcr检测靶mrna表达水平，并通过内参基因actin校正。将提取的总蛋白通过western blot检测靶蛋白的表达水平内参基因actin或gapdh校正。
4. 研究创新点
目前对miR-124靶基因的研究较少，缺少对于靶基因系统的鉴定。本实验试图通过TargetScan预测靶基因并构建基因报告，再通过双荧光素酶、QPCR和Western blot方法将获得一些与神经相关的miR-124靶基因。此外，通过对重要的靶基因进行了功能研究。
5. 研究计划与进展
2019.09～2019.10 构建预测靶基因的报告基因质粒；
2019.10～2019.11 双荧光素酶法验证所预测的靶基因；
2019.11～2019.12 qpcr和western blot进一步鉴定靶基因；
