1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
动物转基因技术最早出现于20世纪70年代中期，是一种通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中从而使其得以表达和遗传的生物技术。随着转基因新技术的出现，转基因动物的制备效率大大提高，使得转基因表达的精确调控得以实现，从而使转基因动物的研究取得了飞速发展，甚至已经进入了产业化的应用阶段。随着转基因植物和转基因动物产品进入产业应用，转基因生物的安全性受到越来越多的关注。在转基因研究中，通常都使用完整重组质粒进行直接转染。这样的载体骨架序列、抗性基因、标记基因的随机整合及遗传会成为不安全因素，令人担忧。载体骨架序列也会整合进染色体中[1-4]，确有研究证明载体骨架序列的整合会带来许多安全隐患。muller等[5]认为载体骨架序列含有回文结构，这些回文结构能够使质粒与质粒之间形成稳定的二级结构，促进异常重组。philip等[6]认为，当载体骨架序列被转录成rna时，这些rna就很可能干扰目的基因rna的合成及加工，且载体骨架序列很可能与转基因的多拷贝有关。stoger等[7]认为外源载体序列和目的基因序列一起整合会带来非常大的转基因位点，而大的转基因位点在立体结构上非常不稳定，易导致在转基因后代中位点的丢失和表达的沉默。如何避免抗性基因、标记基因带来的安全隐患己成为转基因研究的热点。目前，研究者多采用cre/loxp系统、flp/frt系统或r-rs系统等途径将这些不利基因删除[8,9]。虽然采用cre/loxp重组酶系统可以将抗性基因或标志基因等去除，但该方法需要二次转染且技术繁杂[10]。在转基因植物中，将只含有转基因表达所需的基本元件(启动子、开放阅读框和终止子)而不含有载体骨架序列和选择性标记的线形dna，相对于完整的重组质粒，用这种基因表达盒独立转移体直接转化不会降低转化率，而且外源基因的整合与稳定遗传也不会受到影响[11]，还有助于实现比较好的共表达[12，13]。这种方法在转基因水稻[14]、小麦[15]、葡萄[16]及甜瓜[17]中均获得成功。但是，基因表达盒直接转化是否能够使外源基因以较低拷贝数的简单方式直接整合，仍存在着一定的争议。利用这种技术进行动物方面的转基因研究也开始有所报道[18]。
转基因家禽有非常广泛的应用前景，但其应用价值还有赖于确立实用、可行的转基因制备方案。选择家禽作为转基因研究动物是因为其有两大优点，一是由于相对于哺乳动物，家禽胚胎较容易获得，操作方便。二是其能够产生有价值蛋白，是一种高效生物反应器。各种各样的方法已被尝试用于转基因鸡的制备，比如脂质体法、电转染法、慢病毒转染法等。尽管病毒转染法的转染效率较高，但其对胚胎具有一定的危险性。脂质体是由生物可降解组成，具有操作简便、毒性小、转染效率高、对基因无限制、又没有病毒作载体引发生物癌变或变异的可能[19]，且脂质载体的免疫原性通常较低[20]。
经过分析各方法优缺点，本实验拟采用脂质体转染的方法探讨制备转基因鸡的可行性，分别用线性化单酶切、缺失抗性基因的egfp-n1质粒，双顺反子基因转移体cmv-egfp-polya和完整的egfp-n1质粒体外转染鸡胚盘干细胞,初步构建转基因鸡的模型，为寻求制备转基因鸡的最佳方法提供实验依据和基础。
2. 研究的基本内容和问题
研究的目标和内容：
本实验拟采用脂质体转染的方法，分别用线性化单酶切、缺失抗性基因的egfp-n1质粒，双顺反子基因转移体cmv-egfp-polya和完整的egfp-n1质粒体外转染鸡胚盘干细胞，对比分析三者的转染效率，探讨利用线性化质粒制备转基因鸡的可行性。并逐步优化转染条件，探索最佳比例来转染鸡胚盘干细胞，初步构建转基因鸡的模型。旨在寻求最佳转染方案，为制备转基因鸡的最佳方法提供实验依据和基础。
拟解决的关键问题：
3. 研究的方法与方案
研究方法及实验方案：
（1）质粒的制备
大量提取egfp-n1质粒，经紫外分光光度计定量后备用。
4. 研究创新点
本实验用脂质体介导法，将线性化质粒、双顺反子基因转移体CMV-EGFP-polyA转入鸡胚盘干细胞，为制备转基因鸡提供新的思路。
5. 研究计划与进展
2014年10月实验准备阶段：了解实验原理，实验目的、意义和内容，设计实验步骤。
2014年11月实验第一阶段：学习各实验流程所需技术。
2014年12月实验第二阶段：制备转染用质粒。
