锌和海藻糖对热应激大鼠睾丸间质细胞氧化损伤的缓解作用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

热应激是动物在高于等热区上限温度的环境下发生的一系列非特异性生理反应的总称。在热应激状态下，雄性动物阴囊和睾丸的热调节能力失去作用，睾丸的生精机能受到损害，抑制了精子的发生，异常精子数明显增多，造成了热应激状态下精液品质严重下降^[1]。桑润滋等^[2](1999)报道热应激使种公牛原精活力、冻精活力、精子密度、活精子百分数和顶体完整率分别比春季下降3.13%、1.11%、34.8%、15.0%和17.8%,精子畸形率比春季上升255%。田允波(2003)^[3]测定分析了冷冻精子顶体完整率的季节性变化，发现8、9月顶体完整率最低，分别为30.44%和32.75%。terawaki等^[4](1997)报道在8月份高温环境下，活精子数与有完整顶体的活精子仅为76.7%与72.7%，在全年各月份中水平最低。热应激引起的动物繁殖力的降低会造成严重的经济损失。

一般认为，热应激能够诱导o2-、oh-等自由基的产生，导致细胞膜内脂质过氧化物的生成，引起氧化应激，从而造成机体不同部位的氧化损伤^[5]。自由基团进入细胞内会造成蛋白质的异常卷曲、折叠，发生变性，当变性蛋白质蓄积到一定程度时细胞就无法正常发挥功能发生细胞凋亡^[6;7]。并且在持续的高温刺激后，自由基水平仍会继续增加，进而影响细胞正常的生理功能^[8-11]。如何能够降低自由基的氧化损伤，或者能够对受到氧化刺激后的细胞进行修复是抗热应激研究的主要方向。

目前市面上出售的抗热应激药物包括维生素c、维生素e，菟丝子和黄芪多糖等中药提取物，以及一些含有镇静剂成分的药物等^[12]。这其中，抗氧化剂占了绝大多数。而作为一种已经小范围使用的抗热应激物质，海藻糖本身并不能直接与自由基结合发挥抗氧化作用，但可以通过其他两种方式缓解热应激的影响。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标

1. 比对海藻糖和ZnCl₂处理对热处理睾丸间质细胞的影响。

2. 研究海藻糖对热应激睾丸间质细胞的影响及其途径。

3. 海藻糖的保护作用与自噬水平的关系。

研究内容

1. 准备试验动物

购入日龄相近、健康、体重相近且已经达到性成熟的大鼠，在动物房进行饲养以待使用。

2. 制备睾丸间质细胞

（1）处死大鼠

采用颈部脱臼法迅速处死大鼠，转移至无菌操作间内。

（2）无菌采集睾丸

在PBS培养液中去除被膜和血管，打散睾丸实质，放入纯DMEM培养基中。

（3）酶解睾丸间质组织

在培养基中加入I型胶原酶（浓度：10 mg/mL），在34℃水浴条件下震荡（确保培养液在30mL以上）

（4）分离睾丸间质细胞

用滤网进行过滤，收集滤液；在1500r/min下，离心10min，之后洗涤、弃上清、重新加入培养液，用移液器吹打使之均匀分散，重复上述步骤，总计3次。最后收集滤渣，重新加入DMEM FBS 双抗培养基，吹打使之分散均匀。

（5）血细胞计数板计数:

在显微镜下用血细胞计数板进行计数，根据计数结果确定细胞液的分配。

（6）制备细胞培养板

根据计数结果移入96孔板，放入培养箱，12h后观察贴壁情况，待用。

3. 分组情况

4. 处理睾丸间质细胞

（1）配制试验试剂

以配制好的DMEM为溶剂，分别配制海藻糖溶液（100mM/L）、ZnCl₂溶液（100μm/L）、TPEN溶液（15μm/L）适量。

（2）换液

细胞培养24h后，用移液枪洗出培养孔中原培养液，按照预先设定的分组方式注入相应溶液（100μL/孔），放入培养箱继续培养。

（3）热应激处理

换液24h后，对试验组细胞进行热处理（T: 37℃; CO₂%: 5%; t: 2h）。提取细胞液和细胞，待用。

5. 测定相关数据

（1）细胞活力测定

加入四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），继续培养一段时间，利用分光光度仪测定吸光度。

（2）热应激异常蛋白质

利用western-blot测定SOD1水平。

（3）自噬相关蛋白

利用western-blot技术，测定LC-3、mTORC1、SQSTM1蛋白水平。

6. 数据分析

利用Graphpad Prism 5.0数据分析软件对数据进行分析。

3. 研究的方法与方案

研究方法

实验室检测与无菌操作技术

技术路线

4. 研究创新点

1. 以小鼠为模型动物，从提高自噬水平角度出发，研究与传统抗氧化物质相异的抗热应激物质。

2. 在此研究基础上，试探究海藻糖提高自噬水平的方式。

5. 研究计划与进展

项目研究计划

（1） 无菌采集、培养大鼠睾丸间质细胞

（2） 加入对应实验试剂