1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
禽流感是一种由a 型流感病毒引起的禽类烈性传染病,其中高致病力禽流感由部分h5及h7亚型病毒所引起,可导致感染鸡群的全部死亡,从而被国际兽疫局列为a类烈性传染病[1, 2]。近两年多来,禽流感频繁爆发肆虐全球,全世界已有超过1.4亿只家禽染病死亡或遭扑杀,给我国乃至世界上许多国家的养禽业造成了极大的经济损失,更为严重的是禽流感病毒不时跨种传播给人并引起死亡(h7n9和h10n8)[3-5]。对此我国政府和有关科学家们的高度重视,而如何有效控制禽流感的蔓延也已成为国内外学者研究的重中之重。
我国是世界上最大的禽类生产和消费国,江苏省是国内重要禽养殖大省。因此, 有效预防禽流感的发生和传播对我省养禽业将发挥重要的作用,同时也具有重大的公共卫生学意义。目前我国控制禽流感发生的最实际和最有效的途径是应用全病毒灭活疫苗 (油乳剂灭活苗)[6]。如h5全病毒禽流感油乳剂灭活苗,具有安全性好、抗原组分齐全和免疫原性强等特点。但传统的免疫预防接种(肌肉或皮下注射)具有以下缺陷:1) 成本较高、耗时耗力且免疫应激强;2)引起家禽的应激反应影响动物的生长,从而使免疫规程得不到顺利执行;3)传统的免疫预防接种由于多次注射疫苗,体内疫苗残留引起肉制品质量的下降,间接影响食品安全和公共卫生领域;4)禽流感的传染主要是通过呼吸道和消化道途径,而灭活油乳疫苗的免疫方式是通过肌肉注射接种动物,不能激发呼吸道和消化道局部的黏膜免疫[7]。因此,寻找一种简便和安全的免疫途径有效控制禽流感的传播已迫在眉睫。
近年来新兴的黏膜免疫,具有简易、安全、便捷等多种特点等而备受国内外免疫学家的瞩目,现已成为免疫学研究的热点之一。黏膜免疫时,疫苗只作用于动物的呼吸道和消化道黏膜组织(这些部位在禽肉质品加工中均被抛弃),不会对肉制品的质量产生较大的影响,因此,黏膜免疫还有望为提高食品安全和确保禽类制品的质量提供保障。黏膜免疫中口服黏膜免疫多年来受到国内外免疫学家的密切关注,一方面其方法简便、安全,不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答,还可引起全身性体液免疫应答[8, 9];另一方面其免疫效果显著,疫苗经口服免疫后通过上呼吸道粘膜相关淋巴组织不仅有效地诱导局部免疫反应,还可激活淋巴细胞归巢至其他黏膜部位,诱导广泛的黏膜免疫反应,防御病原微生物的入侵,因此通过口服免疫应该能获得较好的效果[28, 29]。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子,脊髓灰质炎口服疫苗的应用,使全球小儿麻痹发病得到有效控制,为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中,口服黏膜免疫也存在不足,如灭活疫苗不能有效诱导局部黏膜产生免疫反应;黏膜免疫时由于疫苗只作用于黏膜表面,极少能有效地进入动物体内; 同时还受到黏膜表面黏液和其它因素的影响,特别是在经过消化道黏膜时,疫苗很容易被破坏,影响免疫力的效果,这些使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制[10-12]。因此,黏膜免疫比一般的系统免疫需要更多的抗原量。所以我们面对的科学问题是:如何使用灭活疫苗安全、高效地诱导黏膜免疫,提高雏鸡的黏膜免疫力已成为急需解决的瓶颈问题。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标：成功完成重组串联整合表达ha和pb1-f枯草芽孢杆菌载体质粒构建。（整合型和质粒型）
本项目进行重组串联整合表达 ha 和 pb1-f2 枯草芽孢杆菌载体质粒的构建，为后期抗原递送载体枯草芽孢杆菌串联表达禽流感病毒 ha 抗原片段和 pb1-f2 蛋白, 后期免疫雏鸡做出,以期提高雏鸡黏膜免疫力做准备。
2.研究的内容
3. 研究的方法与方案
技术路线见附件
4. 研究创新点
本项目方法设计具有创新之处,首次应用重组双功能枯草芽孢杆菌(一方面整合表达可以引起中和抗体产生的血凝素蛋白,另一方面在枯草芽孢杆菌菌体表面展示激活鸡肠道树突状细胞的 PB1-F2 蛋白)促进雏鸡肠道的生长发育, 提高肠道免疫力,进而有效激活消化道和呼吸道粘膜免疫力,抵抗和预防禽流感病毒的 入侵和传播。
本项目从益生菌、黏膜和免疫的角度出发,具有鲜明特色和创新的整体策略。
5. 研究计划与进展
1.9月5号 10月30号
crt，ha，pb1-f2片段的扩增及连接，测序正确
2.11月1号-12月30号
