1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.本课题的意义：
精氨酸是家禽的必需氨基酸，在体内起生理作用的主要是l-精氨酸，除具有氨基酸的一般营养功能外，还可影响肠黏膜的结构和功能，可刺激生长激素(gh)和胰岛素(insulin)的释放，增加机体内氮的储留，发挥调节作用。如果缺乏精氨酸，机体便不能维持正氮平衡与正常的生长发育,精氨酸及其代谢产物如no，还在免疫防御、免疫调节及激素分泌等方面发挥着重要作用。有研究表明，猪妊娠35~45d胎儿尿囊液中精氨酸和鸟氨酸极为丰富,精氨酸对胎儿的发育有促进作用[1~3]。l-精氨酸也是人类超级促生长激素氨基酸(super growth enhancer)的主要成分超级促生长激素氨基酸能有效地营养和调节人体下丘脑垂体-性腺轴激素分泌系统，最大程度刺激人体内源生长激素的分泌。因此为探讨外源营养对肉鸡胚胎后期发育的影响，寻找提高肉鸡早期生产性能的新途径，本试验重点研究胚蛋注射arg对出壳后肉鸡肠道发育和肠道粘膜吸收及屏障功能的影响机制。
2.国内外研究概况：
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标：
本试验旨在探索在鸡胚孵化后期（17.5 d）的羊膜腔中胚蛋注射功能性氨基酸精氨酸（l-arg），研究l-arg对机体营养能量状态的改善作用和对整体生长发育的促进作用，重点研究其对肉仔鸡早期肠道发育的调控作用并揭示其可能的作用机理。
2.研究内容：
3. 研究的方法与方案
1.研究方法：进行动物实验，孵化实验，饲养实验并采集血浆样品和组织样品，并对所得样品进行实验室分析，测定肉仔鸡孵化性能、生长性能、免疫器官指数，肠道早期生长发育和消化吸收功能的相关指标，最后进行统计与分析，根据实验结果确定胚蛋注射L-精氨酸对肉仔鸡早期肠道发育的影响。
2. 技术路线
3.实验方案：
3.1试验设计与方法
3.1.1孵化试验
采用单因素试验设计，孵化16d时照蛋选取720枚蛋重一致（55g）的AA鸡商品代受精蛋，随机分成3个处理，每处理8个重复，每重复30枚，称重后编号。按种蛋正常孵化程序进行孵化，于第17.5 d时进行胚蛋注射。3个试验组注射液如下：（I）：空白对照组，不进行注射；（II）：生理盐水组，NaCl 7.5 g/L（家禽等鸟类生理盐水的浓度）；（III）： L-Arg注射组，L-Arg的浓度为10 g/L（根据预试验结果确定的L-Arg适宜注射浓度）溶于NaCl 7.5 g/L的生理盐水中。
3.1.2饲养试验
出雏后，从每个处理中分别选取体重均匀的80只公雏，随机分成8个重复，每个重复10只，进行饲养试验，饲养期21 d.饲养管理按《AA肉鸡饲养管理手册》进行，自由采食和饮水，饲喂肉仔鸡商品颗粒日粮。按常规的肉仔鸡免疫程序进行免疫。
3.2样品采集
①血浆样品：在饲养试验第1、3、7和21,每个重复随机选出1只鸡。
②组织样品：在饲养试验第1、3、7和21,从上述采血处死的肉仔鸡采集肝脏、腺胃、胸肌、腿肌样品置于1.5 mL RNase-Free离心管中，液氮保存待测。然后分离肠道，分别从十二指肠U状弯曲的起始处和结束处向下取相应肠段，作为十二指肠和空肠样品；从回盲韧带起始处向下取相应肠段作为回肠样品。沿纵向剖开小肠各段，用4℃预冷灭菌PBS缓冲液冲洗外壁和内容物，吸水纸吸干，然后用灭菌刀片迅速刮取肠道粘膜，放入1.5 mL的Eppendor管中，置液氮速冻，-80℃冷冻保存，待测。
3.3指标测定
3.3.1孵化性能、生长性能、器官指数等相关指标
孵化性能和生长性能：计算各处理组孵化率和雏鸡平均初生重；计算1-7d、8-21d和1-21d体增重、采食量和料重比；计算胸肌、腿肌、肝脏、卵黄囊、胰腺、腺胃、肌胃和小肠（分段）以及胸腺、法氏囊、脾脏等分别称重，并计算其相对器官指数，计算方法为：器官指数=器官重量（mg）/仔鸡体重（g）。
3.3.2肉仔鸡肠道早期生长发育和消化酶活力的相关指标
①肠道组织常规形态学检测：将10%福尔马林溶液中固定好的小肠各部分组织，依次经脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→展开→贴片等一系列处理后，用苏木精-伊红（Haematoxylin and Eosin，H. E.）染色制成组织切片，在OLYMPS BX-41TF光学显微镜下，每个部位的组织切片上，随机选10个典型视野（绒毛完整，走向平直），采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统测量每个视野中最长绒毛的高度（VH）、相应的隐窝深度（CD），肠道固有膜厚度，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD）。制作石蜡切片，采用PAS或AB-PAS染色后，测定杯状细胞数量。
②肠道消化酶活性测定：分离小肠三段(十二指肠、空肠和回肠)食糜,装入灭菌EP管内,置于冰盒内后转入-20℃保存。测定前将食糜4℃匀浆30s，匀浆液2500转，4℃离心l0 min，取上清液,用于测定胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。参照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行操作。
③肠组织黏膜酶活性的测定：取小肠（十二指肠、空肠、回肠）黏膜样品50mg左右，准确定量，按重量体积比加预冷生理盐水制备成10%的组织匀浆，4℃下20000*g离心10 min，上清夜-20℃保存，以备酶活性分析。本实验采用南京建成试剂盒测定肠道粘膜酶包括蔗糖酶和麦芽糖酶等二糖酶、碱性磷酸酶、Na -K -ATP酶。 3.4统计与分析所有采集数据先用Microsoft Excel软件进行整理，然后再用SAS 8.1软件对均值进行方差分析和线性分析，如果方差分析效应显著则使用Ducans多重检验比较，显著性水平设置为0.05，数据表示方式为平均数标准差。试验结果绘图采用Origin 8.5软件。
4．可行性分析：
本试验设计科学合理，本人具备扎实的动物营养方向及统计学分析的基础知识。指导教师在本项目领域具有扎实的理论功底和成熟的学术思路，可对实验进行系统指导，保证本项目的顺利完成。该实验难度适中且采用的样品分析技术方法较为成熟。实验室具备完成本项目实施的所有仪器设备及相关技术手段，可为试验的顺利开展提供保障。
4. 研究创新点
l-精氨酸（l-arg）除具有氨基酸的一般营养功能外，还可影响肠黏膜的结构和功能，可刺激生长激素(gh)和胰岛素(insulin)的释放，增加机体内氮的储留，发挥调节作用。
目前胚蛋注射l-arg对肉仔鸡早期肠道发育的影响的研究鲜有报道。
本实验欲通过相关知识和技能，在鸡胚孵化后期（17.5 d）的羊膜腔中胚蛋注射l-arg）研究其对机体营养能量状态的改善作用和对整体生长发育的促进作用，重点研究其对肉仔鸡早期肠道发育的调控作用并揭示其可能的作用机理。
5. 研究计划与进展
2015年7月-2015年8月，查阅相关文献，初步制订试验方案。
2015年9月-2015年10月，完善实验方案，准备试验所需材料。
2015年11月-2015年12月，按照试验方案进行孵化试验和饲养实验，并取得所需组织样,保存备测。
