水稻粒形基因qGS7的精细定位开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1、国内外研究动态

水稻是我国重要的粮食作物之一，其产量的稳定与提高对确保我国粮食安全，具有重要的意义。水稻产量由单位面积穗数、每穗实粒数和粒重三要素决定（matsushimaetal,1966;lietal,1997）。结实率、植株高度、叶型、光合作用等性状间接影响水稻群体产量(sasakietal,2002)。在众多产量因子中，粒重是遗传力相对较高的数量性状，而结实率受环境影响很大(takedaandsaito,1980)。因此粒重也作为育种材料早代选择的重要依据，实践证明增加粒重是提高水稻产量的有效途径之一。然而粒重的提高伴随着稻米垩白率和垩白度上升的趋势，影响稻米外观品质。水稻谷粒的长宽厚直接关系到粒重，同时决定了谷粒的长宽比、垩白率、垩白度等外观品质(heetal,1999;fitzgeraldetal,2009;wangetal,2012)。育种家们逐渐开始关注水稻的粒形，认为适当增加谷粒长宽比，可以减低垩白率和垩白度，同时实现稻米与外观品质的改善。

随着水稻基因组测序完成和分子标记的大量开发，为水稻粒形qtl定位与克隆提供了便利。越来越多的研究采用qtl分析和次级群体解析水稻的粒形qtls。据gramene网站统计，来自不同定位群体所检测到的有关水稻粒重、粒形qtl位点达300多个，其中粒长qtl约80个、粒宽qtl约70个。在这些报道的位点中，有许多qtl在不同的群体中检测到，后经精细定位或图位克隆被证实是相同位点。例如关于粒长的qtllk3(kuboetal.,2001)、gw3.1(lietal.,2004)、lk-4(t)(zhouetal.,2006)、gl-3(wanetal.,2006)、gw3(guoetal.,2009)等报道，大多被证实是gs3(fanetal.,2006)。通过图位克隆和突变体等策略已分离出许多控制水稻籽粒大小的基因，这些基因通过控制颖壳某一方向细胞数目或大小来调控籽粒的长短或宽窄。

2. 研究的基本内容和问题

前期以籼稻品系N643（细长粒）和粳稻品种龙里黑糯矮（圆粒形）作为亲本，经杂交、回交、自交等不同世代表型分析，在回交自交分离家系RHL2401中检测到一个位于第7染色体的控制谷粒长宽比的QTLqGS7。本研究主要致力于在验证前人结果的基础上，利用区间杂合体构建次级分离群体，在标记与表型间进行高精度连锁分析，精细定位qGS7，并进行基因预测、克隆比对和候选基因分析，确定候选基因，并对其进行克隆。

3. 研究的方法与方案

采用SDS提取法提取(Dellaporta,etal.1983)水稻幼叶中的DNA。具体如下：

（1）将插秧一个月后所取水稻叶片剪成0.5-1.5cm长的片段后装入2ml

Eppendorf管中，放入一粒钢珠，加盖写好编号后在液氮中冷冻1-2min，然后用组织粉碎仪（QIAGEN公司TissueLyserⅡ型）磨成细粉（时间20-30s）；

（2）加入400mL预热65℃预热的SDS提取液，混匀，65℃放置15min，每隔2分钟摇匀一次；

（3）加入与提取液等量的酚-氯仿-异戊醇[25:24:1]，颠倒混匀，65℃放置10min，每5min混匀一次；

（4）12000rpm离心5min；

（5）吸取上清液至新1.5mLEppendorf管中，加入等体积预冷的异丙醇，室温静置5min；

（6）12000rpm离心5min；

（7）弃上清，用75%的乙醇洗涤1-2次，7500rpm离心5min；

（8）去除乙醇，超净工作台上风干30min左右；

（9）根据DNA的量加入100~200mL的TE溶液，室温溶解，-20℃保存备用。

（10）验证DNA提取质量：1%琼脂糖凝胶电泳检验。

2.分子标记的开发精细定位区间的首选标记根据McCouch发表的水稻全基因组SSR标记提供的引物序列合成[60]。进一步标记开发是通过比较数据库公布的日本晴序列（参考 http://rgp.dna.affrc.go.jp网站）与93-11基因组（参考http://rise2.genomics.org.cn/page/rice/search.jsp网站）或者（http://rice.genomics.org.cn/rice2/jsp/blast/blast.jsp网站）数据的差异，在插入或者缺失大于10bp的区间两侧设计跨度长度在100-400bp的引物对。用引物设计软件 Primer Premier 5.0（http://www.premierbiosoft.com）设计引物，设计的引物长度为 20 bp 左右，一般要求 GC 含量在 45 %~60 %之间，Tm 值在 55~65 ℃之间，无错配、二聚体和发夹结构，3末端最好是 G 或 C。找到符合以上条件的候选引物序列后，将其用国际生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站上的 primer-blast 软件进行引物特异性比对，选择基因组中特异性较高的序列（即在其他染色体上找不到同源的序列）作为该标记的引物对。通过PCR检测目的条带的差异。将有扩增清晰单一且扩增长度有差异的作为候选InDel标记用于后面的精细定位。

3PCR反应体系与扩增程序

1）试验中所用的PCR反应体系如下：

PCR体系加完后，再在每个体系上面滴加石蜡油盖住体系即可，防止反应过程中温度过高反应混合液的蒸发。

2）PCR扩增程序如下：

94℃预变性5min；

94℃变性30sec；

50-60℃退火30sec；

72℃延伸40sec，35个循环；

72℃保温10min；

4℃保存

退火温度的确定：新订购的引物用亲本在梯度PCR仪进行梯度扩增，确定对目标条带扩增特异性最好的退火温度。

4.电泳检测分析方法

电泳检测过程为将PCR反应产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染显色，具体步骤如下：

1）制胶按照8%的聚丙烯酰胺凝胶工作液配方，配制过程中按照所列顺序依次加入，最后加入过硫酸铵（根据环境温度适量增加或减少其用量），混匀后将丙烯酰胺凝胶倒入玻璃板夹层中，快速插入梳子深度约八成左右，在室温下聚合至凝固。

2）电泳待聚丙烯酰胺凝胶凝固之后，在垂直板电泳槽内加入0.5TBE缓冲液，拔去梳子，10μL扩增PCR产物中加入1μLloadingbuffer，上样2.5μL，根据目的条带的大小，200V电压下电泳1~2h。

可行性分析

（1）本实验室在作物分子遗传育种方面和基因克隆方面具有很好的研究基础；

（2）本实验室拥有室内分子基本操作所需仪器和田间鉴定的条件；

4. 研究创新点

目前已经克隆的粒形基因主要有GW2、qSW5、GS3、GS5、SRS3和SG1等，同时还包括在影响株高或穗型同时影响粒形的基因如直立穗基因DEP1、EP2和EP3，矮秆基因d61/brd1，d2和d1等，同时还有关于7号染色体上qGL7(Baietal，2010)、qGL7-2(Shaoetal，2010；Shaoetal，2012)、qSS7(Qiuetal，2012)与本研究所精细定位的qGS7基因的物理区间比较，qGS7是一个新的位点。

5. 研究计划与进展

2015.52015.6

(1)查阅文献

(2)掌握一些基本的实验技巧