水稻基因组中DR位点的RT-PCR验证开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

意义：模式真核生物基因组的最新的研究表明，除基因组较小的酿酒酵母外，与编码蛋白质基因相比，非编码RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）基因在人和动植物基因组中占了绝大部分比例，例如人和拟南芥基因组中非编码RNAs基因分别占98%和71%。越来越多的研究结果证实，在转录和转录后水平，作为功能性RNAs分子的非编码RNAs通过调节相关基因表达来介导动植物胚胎发育、细胞分化、组织器官发生、信号转导和衰老等正常生长发育过程，另外，非编码RNAs在逆境应答、重大疾病的发生和发展等过程也同样有着十分重要的调节功能。伴随着大规模测序技术的快速发展与应用以及生物信息学分析水平大力提高，高等真核生物非编码基因与非编码RNAs的研究迎来了空前发展的契机。目前，对高等真核生物基因组中种类繁多，长短不一、功能多样的非编码RNAs的功能分析及作用机理的研究正成为当今生物科学研究的热点之一，也是当前兴起的RNA 组学的重要研究内容之一。因此，不同类型的短链(small ncRNAs)和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs)的发现不仅大大丰富了人们对真核生物转录的多样性和复杂性的认识。另外，该研究将有助于从非编码RNAs介导的遗传信息传递方式和表达调控网络等方面来深入剖析生命活动的本质。其研究结果既可为人类疾病的分子诊断，治疗药物的分子设计，又可为高产优质多抗农作物分子育种提供崭新的思路。

人和动物的研究结果表明，短链和长链非编码RNAs在RNAs加工、基因组异染色质形成，组蛋白修饰、DNA甲基化、基因组印迹、基因沉默以及疾病发生等生物学过程中发挥了重要的调节作用^[1,2]。尽管多数lncRNAs的确切功能还不是十分清楚，但部分lncRNAs已被证实与一些重大疾病和发育相关疾病的发生密切相关^[3]，如癌症、神经紊乱和自身免疫疾病等^[4]。目前，植物的研究结果表明，植物ncRNAs在植物正常生长发育及逆境胁迫应答等过程同样发挥了重要调节作用，如植物开花和生物、非生物胁迫应答反应等。并且部分小RNAs的产生及调节机制研究相对比较清楚，但相比之下，植物lncRNAs的研究仍处于起步阶段，无论是在大规模鉴定方法的发展还是在其作用机制的研究等均远落后于人和动物^[5,6,7]。

本项目通过发展和应用DRIP-seq技术在全基因组水平明确水稻DNA-RNA杂合体位点，从而解析通过与DNA结合来发挥功能的ncRNAs（包括lncRNAs）。其中，为证明新方法的准确性，需要进一步对DR位点进行验证，本课题将承担对DR位点的进一步验证工作。

图1

国内外对DNA-RNA杂合体位点的研究概况：人和酵母基因组在转录过程中，一些位点新生RNA链与其DNA模板链结合形成RNA-DNA两链体结构，这种结构也称为R-loops(见图1)。运用DRIP-seq或DRIP-chip方法在全基因组水平鉴定了人和酵母RNA-DNA杂合体位点。酵母基因组中，RNA-DNA杂合体主要富集于rDNA、Ty1和Ty2转座子位点、端粒重复序列区和一些高度转录以及高GC含量的开放阅读框区和PolIII基因区等^[8,9,10,11]。人的基因组中，RNA-DNA杂合体主要在富含G的终止子区以及在富含CpG岛的启动子区形成Rloops，该类启动子通常是DNA低甲基化区^[8,9,10,11]。R-loops的形成是基因组转录过程的自然产物，但人和酵母的相关研究结果证实，R-loops的形成的具有明显的两面性：一方面R-loops形成不利于基因表达，同时可诱导DNA损伤与基因组本身的不稳定性。由于R-loops 形成导致另一条DNA处于单链状态，易受内切酶及其它损伤因子的攻击，最终导致R-loops 对应的基因组位点不稳定。癌症、神经渐形性紊乱和自身免疫等疾病的发生可能与基因组中关键位点R-loops形成有关^[12,13]。另一方面这种结构在基因组中又承担着重要的生物学功能，是基因表达重要的调节因子^[14]。例如，R-loops通过诱导抑制性染色质标记的富集来介导双链RNA相关基因表达的抑制现象^[15]。另外，基因组中天然的反义链转录本可通过形成RNA-DNA杂合体发挥一系列的生物学功能^[16]。例如，R-loops形成可引起转录驱动的核内复制（endoreplication）事件和改变基因组拷贝数等。酵母rDNA 的复制与Rloops的形成密切相关，其中DNA-RNA 杂合体对不依赖于复制原点的复制起着重要调节作用^[17]。在人的 Hela 细胞中发现DNA-RNA杂合体的形成可引起组蛋白H3S10磷酸化和染色质凝缩^[18]。另外，DNA-RNA杂合体的形成与RNAi介导的异染色质形成有关，说明DNA-RNA 杂合体起着染色质相关的ncRNA的调节功能^[19]。因此，在酵母和人等基因组中，DNA-RNA杂合体在人的某些疾病的发生、基因组及表观基因组的稳定性、基因表达、染色质结构的改变、DNA修复和DNA复制等生物学过程起着重要的调节作用。

近来的研究发现，R-loops也参与了动植物ncRNA的调节作用。例如，拟南芥AtNDX通过稳定COOLRIR启动子区R-loop结构参与lncRNA-COOLRIR介导的转录水平调节，进而影FLC 基因的表达^[20]。另外，通过RNADNA杂合体位点来直接鉴定基因组中与DNA结合的ncRNAs 的研究仅在大肠杆菌中出现报道^[21]。目前，在人和动植物中，通过RNA-DNA杂合体位点来直接鉴定基因组中与DNA结合的ncRNAs的研究还未见报道，特别是植物基因组中，相关研究还有待广泛开展。

应用前景：植物ncRNAs的研究，特别是lncRNAs，是整个植物界中一块发展迅速且极其重要的领域，其形成机制和作用机理还有待于进一步深入研究。与酵母和人相比，植物DNA-RNA杂合体的鉴定及功能研究远远滞后。因此，在植物中开展DNA-RNA杂合体的鉴定和功能分析，一方面有利于鉴定新的ncRNAs，特别是lncRNAs，从而大大丰富植物ncRNAs的数量和类型；另一方面有利于明确植物基因组中DNA-RNA杂合体(R-loops)的形成与那些植物生物学过程密切相关，从而有利于从DNA-RNA杂合体方面解析植物ncRNAs的作用机制，为植物ncRNAs 的研究提供新的思路。

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2. 研究的基本内容和问题

研究目标：验证DRIP-seq技术鉴定的部分DNA-RNA结合位点的准确度。

研究内容：运用链特异的RT-PCR，对DRIP-seq方法鉴定出的部分DNA-RNA杂合位点进行PCR验证。

拟解决的关键问题：初步验证生物信息学方法是否准确。

3. 研究的方法与方案

研究方法：链特异性rt-pcr

技术路线：

4. 研究创新点

本项目将首次发展和运用drip-seq和链特异型drip-seq技术，鉴定植物基因组dna-rna杂合体位点。

其次将综合利用相关表观组学研究方法，阐明dna-rna杂合体位点的表观遗传学特征。

另外，本项目将首次尝试运用dripseq方法在植物基因组中鉴定ncrnas尤其是lncrnas。

5. 研究计划与进展

2015年

10月-11月：熟悉实验室环境，学习相应实验技能及仪器操作。

11月-12月：取得生物信息学方法分析结果，根据dr位点基因序列设计特异性引物并进行rt-pcr验证，初步验证基因间区、内含子区、外显子区、5utr、3utr区各5个和启动子区35个共60个位点。