1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1禽流感的研究进展
1.1.1禽流感的危害和流行状况
禽流感（avian influenza, ai）是由禽流感病毒（avian influenza virus, aiv）引发的一种疾病综合征[1]。禽流感不仅会对养禽业造成严重危害，而且还会对禽类食品造成潜在的危险，从而严重危害到人类的食品安全[2]。根据致病力和毒力的不同，将禽流感病毒其分为高致病性、低致病性和无致病性三种[3]。高致病性禽流感有着高致病性、高发病率、高死亡率的“三高”特性，对养殖业有着极其严重的危害。低致病性禽流感则可引发家禽轻度的呼吸困难、产蛋量下降等临床病症。
2. 研究的基本内容和问题
禽流感病毒因为其易变异性和普遍的感染率，对养禽业造成了极其严重的危害，且能感染人。新城疫病毒则以其高传播速度和强致病性不断危害家禽生命健康。新城疫与禽流感混合感染发病率高，如今防范措施主要为接种疫苗，但由于接种的疫苗质量良莠不齐、免疫效果不理想、免疫有效时间偏短等问题，常常造成免疫失败；加上病毒易发生重组和变异，使得疫病的防控变得更加困难。寻找安全且高效的疫苗制剂具有重要的意义。
法氏囊是禽类特有的中枢体液免疫器官。法氏囊多肽是从法氏囊中提取出来具有免疫活性的小分子多肽，已证实其有一定的免疫活性。实验室对法氏囊多肽有多年的研究，但对于法氏囊五肽（BP3）的研究还不够完善，作为新发现的法氏囊活性肽，对于其潜在的免疫特性和使用剂量方面仍然需要进一步的探索。本试验拟研究BP3对禽流感-新城疫二联苗免疫效果的作用，通过比较不同浓度的法氏囊五肽对二联灭活苗的免疫效果的影响，为开发法氏囊多肽免疫佐剂或疫苗增强剂提供依据。
3. 研究的方法与方案
1多肽的制备
委托商业化多肽合成公司按照BP3序列合成多肽，纯度为99.936%。
2多肽对二联苗的影响
2.1实验分组
将BALB/C小鼠随机分为五组，每组10只。
（1）PBS对照组（每只用0.2ml PBS免疫）
（2）AIV NDV二联灭活疫苗免疫组（每只免疫0.2ml灭活疫苗）；
（3~5）AIV NDV二联灭活疫苗 BP3组（BP3浓度分别为10、50、250μg/mL）；
采用腹腔注射的方式对每组小鼠进行两次免疫，免疫间隔为两周，0.2ml/每只/每次（表1）。
|
| 0周（第一次免疫） | 2周（第二次免疫） |
| 1 | PBS | PBS |
| 2 | 二联疫苗 | 二联疫苗 |
| 3 | BP3(10μg/mL) 二联疫苗 | BP3(10μg/mL) 二联疫苗 |
| 4 | BP3(50μg/mL) 二联疫苗 | BP3(50μg/mL) 二联疫苗 |
| 5 | BP3(250μg/mL) 二联疫苗 | BP3(250μg/mL) 二联疫苗 |
表1：BP3与AIV NDV二联灭活疫苗混合免疫程序
2.2血清特异性IgG检测
小鼠二免后两周和四周，分别进行眼眶采血，所采血经8000×g离心10min分离血清；
使用已包被的ELISA板进行血清抗体效价的检测；
（1）在U型抗原抗体反应板上用血清稀释液以1：200的比例稀释待测血清。
（2）将100μL稀释好的混合液转入到包被好抗原的ELISA板中，37℃、5%CO2的恒温箱中孵育45 min。
（3）用PBST洗五次ELISA板并拍干；将HRP标记的羊抗鼠二抗稀释后，每孔加入100 μL，37℃、5%CO2的恒温箱中孵育30 min。
（4）用PBST洗五次ELISA板并拍干；将等体积混合的A、B显色混合液以100 μL/孔加入酶标板中，37℃、5%CO2的恒温箱中孵育10 min。
（5）在孵育完毕后的酶标板中每孔加入100μL2M H2SO4。立即于酶标仪中读取450nm波长下光吸收值。
2.3血凝抑制试验（HI）
（1）先在96孔V型板中每孔加入50μL生理盐水。
（2）在每行第一个孔加入50μL待测血清，混匀后取出50μL 加入到第2孔。如此倍比稀释至第 11 孔，第11孔弃掉50μL，第12孔作为对照孔不加血清。
（3）根据结果，制备4个血凝单位的病毒稀释液。
（4）将V型板放入温箱10 min。
（5）每孔加入50μL 1%鸡红细胞。
（6）微型混合器上振荡2min后，放入温箱15min 后观察结果。
2.4T淋巴细胞增殖实验
（1）每组取一只小鼠，脊椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒，在生物安全柜中取出浸泡后的小鼠，用剪刀无菌采取脾脏，用镊子取脾脏深部组织于无菌平皿中，用灭菌PBS液洗涤3次。
（2）将脾脏包裹尼龙网转移至平皿中，加入6-8mLPBS充分研磨；然后将平皿中的悬液转入到15mL离心管中，1000rpm/min离心10min，弃上清。
（3）每管加入红细胞裂解液2-3mL，静置3min，1000rpm/min离心5min，弃上清。
（4）用6-8mL无血清RPMI1640清洗3次，使用含10%血清的1640培养液2mL重悬，取30μL重悬液于细胞计数板上观察细胞浓度。并将细胞悬液浓度调整到3×106/mL。
（5）在96孔细胞培养板中每孔加入100μL调整好浓度的细胞悬液。
（6）在96孔板中分别用包含免疫增强剂的灭活疫苗、LPS、PHA（10ng/mL）作为阳性对照，仅灭活疫苗刺激物作为阴性对照。每一个刺激剂量设置3个重复。
（7）将细胞培养板放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养48h。
（8）48h后每孔加入20μL5mg/mLMTT，混匀后放入含有37℃，5%CO2的恒温箱中4h，3500rpm/min离心5min，弃去上清后每孔加入100μLDMSO，并混匀至晶体溶解，然后将细胞培养板放于酶标仪中读取结果。
2.5流式细胞仪检测
在2 mL离心管中加入100μL以上2.2.2.4中（1）～（4）制备成的细胞悬液。加入流式抗体CD4-APC、CD8-PE进行T细胞亚型的检测，以及CD40-APC,CD80-APC,CD86-APC,MHC-Ⅱ-APC进行DC细胞共刺激因子检测。室温避光30 min，然后1000 rpm/min离心7 min。使用PBS清洗3次，然后1000 rpm/min离心7 min。最后用400μL PBS重悬细胞，然后用流式细胞仪进行检测。
4. 研究创新点
现今对BP3的研究较少，把法氏囊多肽和禽流感新城疫二联苗一起研究，不仅促进疫苗的发展，还能探究法氏囊多肽对免疫学特性。
5. 研究计划与进展
用ELISA、血凝抑制实验、MTT、流式细胞技术来研究BP3对禽流感新城疫二联苗的影响。
预计2019年3月前完成全部实验工作和数据的整理。
