1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1课题意义：
畜牧业是我国国民经济的基础产业和农村经济的支柱产业，养猪业则是畜牧业的重要产业部门。我国幅员辽阔，养猪历史悠久，养猪经验和品种资源极为丰富，养猪数量稳居世界榜首，并推动了世界养猪业的发展；随着我国人口的不断增加和生活水平的提高，猪肉市场不断扩大，猪肉的需求量也呈逐年上涨的趋势。近年来，消费者在饮食方面尤其是对品质优良的猪肉需求意识也在不断加强。因此，改善猪肉品质已经成为发展猪肉产业的重要目标，也是遗传育种研究的关注热点。
度量猪肉的品质性状一般包括大理石花纹、肉色、ph值、嫩度、系水力、眼肌面积、背膘厚、风味、色泽和肌内脂肪含量等方面。其性状受到诸多因素的影响，如饲养管理、屠宰、肉质加工、营养、遗传和环境等，是典型的数量性状，由微效多基因控制，通过研究肉质性状，我们可以了解猪肉肉质的遗传机理，对改善猪肉风味，提高猪肉的食用价值以及选育优良健康的猪种具有重要意义。
2. 研究的基本内容和问题
2.1研究目标
本研究用RFLP技术对前期GWAS筛选出与猪肌内脂肪显著相关的SNP进行验证，此SNP在ROR1中，随后检测ROR1在高低肌内脂肪中的表达情况，从而进一步验证ROR1与猪肌内脂肪含量的相关性。
2.2研究的内容
2.2.1索氏抽提测定肌内脂肪含量
1.将定量滤纸分摊在洁净的搪瓷盘中，105℃烘干2h以上，直至其重量没有变化为止。用精密天平(感量：0.00001g)准确称量烘干后滤纸的重量(W1)。(注：滤纸放干燥器中，一定不要忘了先称滤纸重量)
2.将2-3g肌肉样剪碎后用烘干滤纸包裹，称量纸包重量(W2)。将纸包分摊在洁净的搪瓷盘中，放入烘箱中，65℃烘干15h以上(可过夜)，直至其重量没有变化为止。称量烘干后纸包的重量(W3)。(注：此时的称量应将滤纸包放在干燥器当中，且每次称量拿出的顺序最好一致，减少误差。分析天平中放无水硫酸铜干燥包。铅笔标记)
3.将烘好的滤纸包放入索氏抽提器中，倒入无水乙醚浸泡过夜(乙醚必须全部淹没滤纸包)，第二天早上打开乙醚回流装置，75℃回流9h以上。(注：乙醚容易挥发，应该在瓶口用水封口，并且定时观察回流状态，及时的补充乙醚)
4.抽提完毕后取出滤纸包分摊在洁净的搪瓷盘中，在通风处发挥完乙醚30min，(也可使烘箱先半开门烘一段时间，使乙醚充分挥发)，105℃烘干2h以上，直至其重量没有变化为止，称量烘干后纸包的重量(W4）。
5.计算：由于实验条件限制，本实验中以粗脂肪含量来近似表示肌内脂肪含量。
肌内脂肪（）×100
2.2.2 DNA的提取及稀释
1.取液氮中的组织（50mg），加入800ml 裂解液和30ulProteinase K（20mg/ml），尽量剪碎后颠倒混匀，55℃孵育过夜，期间可以轻柔涡旋帮助完全裂解。
2.提取前加入1.8ul RNase A（20mg/ml），颠倒混匀后37℃温育15min，冰浴
3.加入等体积Tris饱和酚800μl，上下颠倒混匀10min（不可剧烈混匀，防止切断大片段DNA）；4℃、12000r/min离心15min。
4.吸取上清650μl至新的EP管中,重复3）的步骤。
5.吸取上清600μl至新的EP管中，加入等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇（25241），上下颠倒混匀10min；4℃、12000 r/min离心15min。
6.小心吸取上清500μl至新管中，加入500μl等体积氯仿/异戊醇（241），颠倒混匀10min；4℃、12000r/min离心10min。
7.小心吸取上清400μl至新管中，加入1/10体积的3MNaAc，混匀后加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀-20℃放置20min后，12000rpm离心10min。
8.倒出液体，注意不要倒出沉淀。用1ml 70％乙醇洗剂两次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。
9.超净工作台吹干或者室温晾干。
10.加入50ul ddH2O溶解DNA样品，必要时可于55-60oC下孵育10min助溶。
2.2.3对高低组进行酶切分型
1.建立20ul的反应体系，体系包括ddH2O(7ul)、rTaq酶(10ul)、引物R(1ul)、引物F(1ul)以及DNA模板(1ul)，混合加入200ul Ep管，震荡离心后，进行PCR，PCR循环为：94℃ 5min；(94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s)ⅹ36；72℃ 7min，10℃ fever。
PCR引物见表格1。
| 引物名称 | 5’-3’ |
| ROR1 酶切分型引物F | AATGAGCAAGCCAGGGAT |
| ROR1 酶切分型引物R | GTCTGTTTGCTATAAATATTAATTTTC |
| BD-ROR1-F | ACAAACGGCAAGAAAGTGG |
| BD-ROR1-R | AGTACGGGAAGGCATAGTGG |
表格1
2.向含有PCR产物的200ul Ep管中加入0.5ul的Ddel，放入37℃水浴锅中酶切2h。
3.水浴结束后，琼脂糖凝胶电泳100v跑35min。
4.观察结果，对比标准图谱，对SNP进行分型整理(出现明显的一条带：表示TT纯合型；明显的两条带：表示CC纯合型；明显的三条带：表示T/C杂合型)。
2.2.4 RNA的提取
1.样本裂解：加入1ml Trizol，充分消化后收集于1.5ml离心管中，置于-80℃，待实验时取用。若为6孔板或12孔板培养皿，其中还有其他样品，需要加入PBS洗涤空孔，以防Trizol残留挥发消化其他细胞。
2.抽提：加磁珠，匀浆(细胞可省略)-60s1-2次/ 其他-60s 2-3次；加入200ul氯仿，震荡15s，静置15min(细胞5-6min)；离心12000rpm，4℃ 10min，分层，吸取上层水相500ul左右。
3.沉淀：吸取上层水相至1.5ml离心管，加入等体积异丙醇(-20℃预冷)，震荡15s，静置10min；离心12000rpm，4℃，15min。
4.洗涤：弃上清，加入1ml无RNase 75乙醇(DEPC溶解)，悬浮沉淀，7500rpm，4℃，5min；重复以上操作；离心2min，吸掉残留液体。
5.RNA沉淀溶解与保存：晾干去除残留乙醇；加入30-100ulDEPC水溶解RNA，若沉淀难以溶解，可将离心管放置于68℃恒温水浴锅中加热10min。
2.2.5 RNA的反转录
建立10ul的反应体系，体系包括Mix(2ul)、RNA(5ul/500ng)以及ddH2O(3ul)，混合加入200ulEp管，震荡离心，进行PCR，PCR反应程序为：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃fever。
2.2.5定量ROR1在肌内脂肪中的表达
1.建立20ul的反应体系，体系包括ddH2O(8.2ul)、qPCR Mix(10ul)、引物R(0.4ul)、引物F(0.4ul)以及DNA模板(1ul/200ng)，混合加入200ul Ep管，震荡离心，进行PCR，PCR反应程序为：94℃ 5min；(94℃ 30s，58℃ 15s，72℃ 1min)ⅹ32；72℃ 10min；4℃ fever。(需注意的是此时的引物R和F与酶切分型所用的不同；此时的DNA模板是通过RNA反转录得到的cDNA)
PCR引物见表格1。
2. 利用2-△△Ct计算基因的表达量。
2.3拟解决的关键问题
1.通过PCR-RFLP方法对GWAS技术筛选出的SNP进行分型验证。
2.此SNP在基因ROR1中，进一步利用荧光定量PCR技术检测ROR1基因在高低肌内脂肪中的表达，观察ROR1的表达量是否存在差异。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法
3.1.1索氏抽提法
测定脂肪含量的方法有很多，例如抽提法、酸水解法、核磁共振法和比重法等等，其中索氏抽提法是目前国内外普遍采用的方法，是公认的经典方法，用于测定粗脂肪的含量。它的作用原理是利用脂肪可以溶于有机溶剂的性质，用无水乙醚或石油醚等溶剂将待测物长时间浸润而将所需要的物质浸出来，反复萃取后提取样品中的脂肪，使溶剂充分挥发，最后得到粗脂肪。索氏提取适用于提取溶解度小且不易受热分解的物质，虽然存在着抽提时间过长、测量含量稍低于实际值和抽提瓶不易恒重的问题，但相对于其他的测量脂肪的方法，具有稳定性好、准确率高、节约溶剂和提高萃取效率的优点。采用该方法是需要注意滤纸的高度不能超过虹吸管，否则上部脂肪不能提尽而造成误差。
4. 研究创新点
4.创新之处
通过查找和阅读文献，前期的实验中利用荧光定量PCR分析ROR1在肌内脂肪表达情况的研究尚浅。本实验的创新之处在于，不仅采用酶切的方法对高低组的样本进行分型，同时通过荧光定量PCR观察ROR1基因在猪肌内脂肪的表达情况。
5. 研究计划与进展
5.研究计划及预期进展
| 序号 | 起止日期 | 实验阶段 |
| 1 | 2018/08-2018/09 | 采集新鲜的猪的样本并做好标记 |
| 2 | 2018/09-2018/10 | 用索氏抽提法提取样本中的脂肪并做好标记 |
| 3 | 2019/02-2019/03 | 熟练掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等相关的基本操作方法 |
| 4 | 2019/03-2019-04 | 完成PCR-RFLP、酶切分型、跑胶的毕设内容 |
| 5 | 2019/04-2919-05 | 做实验的同时，整理好笔记和相关的资料 |
| 6 | 2019-05 | 写毕业论文，并准备毕业答辩 |
