1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1. 课题意义我国肉羊种质资源丰富，是世界第一肉羊养殖大国。
然而，我国肉羊多为地方品种，普遍存在着生长速度慢、出栏体重轻、屠宰率低等产肉性能不高的问题，是规模化舍饲养羊提质增效面临的重要瓶颈。
因此，提高产肉性能是当前肉羊生产中要解决的重大课题之一。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
(1) 验证前期的测序结果。
(2) 以110d胎羊、出生1d、3月龄和2岁湖羊背最长肌为研究对象，分析与肌肉发育相关基因的表达水平。
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1 试验动物
不同年龄段湖羊背最长肌样品均采自泰州海伦羊业有限公司
1.2 样品采集
取试验动物背最长肌，将采集的组织样品用生理盐水冲洗掉血液，立即用75%乙醇预先处理的手术刀片切取适量组织，用锡箔纸或者纱布包裹，拴上标签，立即投入液氮中，带回实验室，-80℃冰箱中冻存备用。
1.3 样品分析
(1) RNA提取
① 匀浆处理：每个样品做一个平行样，将1Ml TRNzol加入2mL的管中之前，将2mL的管加入少许液氮（以便冷却离心管以免造成RNA降解），立即将液氮里取出160-200mg以内的样品放入其中，用涡旋振荡器振荡2min；
② 将匀浆样品在冰上放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离；
③ 4℃，12000r/min，离心5min，将粘在离心管的脂肪用200mL的枪头取出，吸取上清，移入新的2mL离心管中；
④ 在取下层溶液时很容易吸到了油脂，为保证完全去除油脂污染。需重复抽提一次；
⑤ 用100mL移液枪吸取上清液移入1.5mL离心管中；加入0.2mL的氯仿，盖好管盖，用手剧烈的振荡15s，冰上放置5min；
⑥ 4℃，12000r/min，离心15min，将两个平行样吸取上层水相，都置一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻摇混匀，冰上放置10min；
⑦ 4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，按1mL75%的乙醇（DEPC水配制）/mLTRIzol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
⑧ 4℃，12000r/min，离心5min，尽量弃上清，室温放置晾干6-10min，不可晾的太干，根据沉淀量的多少加入15-20μL的RNAse-free ddH2O，反复吹打，混匀充分溶解RNA；
⑨ 从提取的RNA溶液中分装出4μL，用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和RNA的浓度测定。提取的RNA溶液保存于-80℃超低温冰箱中。
(2) 提取RNA的完整性与浓度和纯度检测
取2μL总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28s，18s条带清晰可见，要求28s与18s亮度比约为2:1。取2μL总RNA测定浓度及纯度。
(3) 反转录
用Takara的反转录试剂盒分两步法对RNA进行反转录。反应液的配置在冰上进行。在反应体系中根据RNA的浓度来确定加入RNA的体积大小，使总RNA的量保持一致。各反应体系见表1和2。
表1去除基因组DNA反应
Table 2 The reaction ofremove genomic DNA
| 试剂 | 体积 |
| 5×gDNA Eraser Buffer | 2.0 μL |
| gDNA Eraser | 1.0 μL |
| 总RNA | 最多1 mg |
| RNAse free 水 | 加至10 μL |
反应条件如下：42℃2min；4℃ 。
表2 cDNA的合成
Table 2 The synthesis of cDNA
| 试剂 | 体积 |
| 第一步的反应产物 | 10.0 μL |
| PrimeScriptRT Enzyme MixⅠ | 1.0 μL |
| RT Primer Mix | 4.0 μL |
| 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) | 4.0 μL |
| RNAse free H2O | 1.0 μL |
| Total | 20.0 μL |
反应条件如下：37℃15 min；85℃ 5 sec；4℃。然后产物置于-20℃长期保存。
(4) 荧光定量PCR检测
① 引物设计与检测
从NCBI中分别查到所要测得羊的目的基因序列，然后采用Oligo6.0软件跨内含子设计目的基因引物，引物由上海英俊合成。将引物用灭菌水超纯水处理，溶解稀释成10uM的贮存液，-20℃保存。
反应程序为：95℃，3min；95℃，30s；57℃，1min；72℃，1min；35个循环；72℃，5min；快速冷却至4℃。
2%琼脂糖凝胶电泳检测，要求引物扩增目的片段条带清晰明亮，没有杂带。先设计温度梯度PCR检测引物扩增的最适温度范围，要求用设计好的引物扩增后结果显示待测基因的扩增反应最适温度相近。
② 荧光定量PCR检测方法
管家基因为GAPDH，用来消除每份样品所含RNA量的不同造成的影响，以目的基因与内参基因GAPDH的比值为目的基因的表达量。所有的样本都同时做三个重复，剔除不合理的测定值取其平均值。整个反应在实时定量PCR仪中进行，为保证特异性的扩增，要求得到的溶解曲线只有一个峰。
③ RT-PCR产物检测
取5 μLRT-PCR产物与1 μL 6ⅹLoading buffer混匀，上样至琼脂糖凝胶电泳100V，20 min检测。
④ 结果采用2-△△CT法对目的基因表达水平进行相对定量分析
(5)亚硫酸氢盐测序PCR (BSP)
基因组DNA亚硫酸氢盐转化的处理采用EZ-Gold DNA甲基化试剂盒（ZYMORESEARCH, USA）进行，处理过程中需要在避光条件下进行快速操作，所以需要将离心管使用铝箔纸包裹。
① 配制CT Conversion Reagent与M-WASH BUFFER
试剂盒中所提供的CT Conversion Reagent是固体混合物并且一定要在首次使用前制备好。通过添加900μL水，50μL的M-Dissolving Buffer和300μL的M-Dilution Buffer到一管的CT Conversion Reagent中。在室温下溶解并且震荡10min或在摇床上摇动10min。添加24mL100%的乙醇到M-WASH BUFFER中来制备最终可以使用的M-WASH BUFFER。
② 每次制备的DNA范围在500pg到2μg之间。最佳量为200~500ng。在PCR管中添加130μL的CT Conversion Reagent到每20μLDNA样品中。如果DNA样品的体积小于20μL,则用水来弥补差量。通过轻弹试管或移液器操作来混合样品。
③ 将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作：
a.98℃放置10min；
b.64℃放置2.5h；
c.立刻进行下述操作或者在4℃下存储（最多20h)；
d.添加600μL的M-Binding Buffer到Zymo-Spin IC Column中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中；
e.装填样品（从步骤b）到Zymo-Spin Column含有M-Binding Buffer。盖上盖将柱颠倒数次来混合样品；
f.全速（10,000g）离心30s。去除流出液；
g.添加200μL的M-Wash Buffer到柱中。全速离心30s；
h.添加200μL的M-Desulphonation Buffer到柱中并且在室温（20℃~30℃）下放置15~20min。在培养后，全速离心30s；
i.添加200μL的M-Wash Buffer到柱中。全速离心30s；再添加200μL的M-Wash Buffer并且离心30s；
j.直接添加10μL的M-Elution Buffer到柱基质中。将柱放置在1.5mL的管中。全速离心来洗脱DNA；
k.DNA可立刻进行分析或储存在低于-20℃下以备以后使用，对于每次PCR使用2~4μL洗脱的DNA。
由于基因组DNA经过亚硫酸盐转化后，由于DNA甲基化结构遭到破坏而引起DNA结构很不稳定。所以转化处理后的DNA，尽量直接用于扩增试验；转化后没有使用完的DNA应该分装冻存于-80℃冰箱中，每次使用时应注意避光和避免反复冻融。
每个样品需进行3次或3次以上转化处理，以保证基因组DNA处理完全，以确保后续实验结果的正确性。
④ CpG岛预测、特异性引物设计与PCR扩增
根据MethPrimer在线软件对基因的DNA甲基化CpG岛预测，选择合适的CpG岛区域作为研究片段。
⑤PCR扩增产物连接T载体和测序
以每个样品完成3次转化的DNA为模板进行扩增。扩增产物电泳利用DNA凝胶回收试剂盒（天根，中国）进行目的片段扩增。将回收的扩增产物一分为二，一份用于BSP试验，一份用于COBRA试验。胶回收产物与pMD18-T载体（TaKaRa, 大连)，置于冰箱4℃连接，过夜。转化涂板后每个胶回收产物挑取4~5个单克隆进行DNA测序（生工生物工程股份有限公司，上海）。如果每个样品进行3次扩增，即在各个样品上都有12~15个BSP测序结果。
(6)结合重亚硫酸盐处理和酶切（COBRA）分析
将每个样品凝胶回收产物收集到一个离心管中，混合均匀，加入适量的限制性内切酶Taq I（Takara, 大连），37℃消化8h。将酶切消化的产物进行3.5%的琼脂糖凝胶电泳分析。DNA经过亚硫酸氢盐处理后，甲基化的C保持不变，而没有甲基化修饰的C被转化为T。如果目的片段的酶切位点（Taq I的5’-TCGA-3’）处的C为甲基化状态，酶切位点则会被切开。如果目的片段的酶切位点处的C为非甲基化状态（亚硫酸氢盐处理后会将C被转变为T），限制性内切酶就不能识别这个酶切位点，故保持扩增长度的目的条带。根据上述原理，将切开的条带的亮度和所有条带的亮度的软件（quantityone software,Bio-Rad）分析，可间接表示该酶切位点总体甲基化水平。
(7)数据处理与统计分析
基因表达水平和甲基化水平差异的显著性检验通过SPSS统计分析软件（Version18.0，美国）分析，结果以平均值±标准误（mean±standarderror，mean±SE）表示，组间比较采用LSD法。P0.05为显著性差异，P0.01为显著性极差异。BSP测序的结果使用QUMA（Kumaki andOkano 2008）或者BiQ Analyzer软件（Bock etal. 2005）分析BSP测序结果的的DNA甲基化转化率，并将DNA甲基化结果以圆圈图输出。
2.技术路线
3. 可行性分析
（1）本试验材料来源广泛且有保障。
（2）本试验的研究工作将在江苏省肉羊产业工程技术研究中心进行，该中心现有生物安全柜、通风橱、离心机、摇床、低温冰箱，PCR仪，荧光定量PCR仪等大型仪器设备，可完全满足本试验仪器设备的要求。
（3）本中心多年从事肉羊育肥工作，建立了成熟的技术流程，积累了较为丰富的经验，具有良好的工作基础。
（4）本人有较好的实验操作能力，了解实验过程和实验仪器的使用，有较好的理论和试验基础。
（5）本项目指导教师王锋教授是国家肉羊产业体系岗位科学家，江苏省肉羊产业工程技术研究中心主任，长期从事肉羊育肥及改善其肉品质方面的工作。该指导老师能够在实施本项目过程中有足够的时间保证，确保本项目顺利完成。
4. 研究创新点
本试验首次探究湖羊肌肉发育关键基因随日龄增加而变化的趋势，通过亚硫酸氢盐PCR测序（BSP）及qRT-PCR验证测序结果并分析与肌肉发育相关基因的表达水平，为进一步研究靶基因在肌肉发育中的作用及机制奠定了理论基础，对研究肌肉形成与发育的分子调控机制具有重要的意义。
5. 研究计划与进展
2018年9月——2018年10月
查阅、研读相关文献资料，制定具体的试验方案及实施措施；
2018年10月——2018年11月
