1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
在对于叶绿体功能的研究中，利用ems的方法产生大量的叶绿体蛋白突变性状的拟南芥，在这些突变拟南芥中，有一些植株表现出较为特殊的性状。这些突变植株都表现为黄色矮化植株，同时在叶缘会出现不正常的卷曲，和其他突变株类似的是，这种突变植株的生长活力低于野生型（wt）[1]。鉴于该突变植株叶缘的卷曲这一特殊性状，研究人员将其命名为crl突变株，同时做出猜想是叶绿体内某蛋白控制突变植株性状的表达（该蛋白命名为crl）。[2]进一步研究突变植株，在细胞水平发现，crl的叶肉细胞发生过敏性反应（hr）以及细胞程序性死亡（pcd），[3]严重时会发生大量死亡细胞聚集的斑点。对叶片亚细胞结构观察时发现，crl植物细胞的叶绿体较wt植物细胞叶绿体发生了巨大变化，变化主要体现在叶绿体伸长、叶绿体数量减少、单个叶绿体巨型化；[4]在叶绿体发生变化的同时，crl细胞的线粒体也发生了形态结构的异化，这暗示crl的两种质体之间存在潜在联系。[5]对crl选蛋白进行定位研究后发现，类似于整合膜蛋白，crl蛋白大部分定位于叶绿体的内膜中，但其具体的功能尚且未研究清楚。但是和一般pcd形成原因有所不同，crl细胞的pcd是因为基因直接影响crl蛋白的表达，从而加剧细胞的程序性死亡；而不同于线粒体是通过增加其表面膜渗透性，释放线粒体内部关键蛋白如细胞色素c，最终导致细胞的程序性死亡。[6]
在研究crl细胞程序性死亡时，有研究发现凋亡细胞及周边细胞的单线氧含量较wt细胞含量高，而且经检测发现，组织内的活性氧（ros）成分含量显著上升。[7]一般而言，植物体内的ros含量显著增长，和植物组织或细胞受损直接相关。有研究表明，在拟南芥被丁香假单胞菌侵染过程中，细菌在植物细胞内部造成的破坏从而产生大量的ros。[8]从植物病害的角度分析，当病原物的pamps接触植物表面的prr时，刺激植物细胞内部的pti抗病机制；而pti下游的信号包括钙离子信号、mapk级联信号以及ros信号等等，因此，在病原物侵染植物细胞或组织时，会诱导出大量的ros。[9]同时，如果从外部对植物产生机械损伤，植物组织也会被测出大量的ros存在，这一现象表明，无论是细菌侵染还是机械损伤，一旦出现了对植物生长不利的胁迫，那么植株会即刻生成大量的ros以响应胁迫造成的损害。这种胁迫可能是生物胁迫，也有可能是物理胁迫，或者是化学胁迫，因为有实验证实，如果直接使用h2o2处理植物组织，过氧化氢也会直接诱发细胞产生大量的ros。
ros在植物体内大量生成是为了响应逆境刺激胁迫，但是过量的ros反而会破坏植物自身的组织结构，因此如果ros在植物抗胁迫体系中有重要的作用，那一定会产生下游信号进一步应对逆境胁迫。在对ros潜在下游信号分子探索中，有实验发现oxi1蛋白可能是一个关键的信号分子，因为无论是细菌病原物侵染还是机械物理损伤植物组织，都能检测到oxi1蛋白的存在。进一步研究显示，oxi1在植株被侵染或损伤之前只会维持一个稳定却较低的含量；在经历胁迫后，植物体内的oxi1会被大量诱导表达。因此进一步作出推测，作为一种诱导性激酶，oxi1可能是响应植物体内大量ros生成的下游关键信号因子。此外，oxi1蛋白和mapk家族蛋白的级联信号有一定联系，而mapk蛋白家族和pti抗病系统直接关联，所以oxi1和植物抗病有潜在的关联；除此之外，有研究表明oxi1和mapk3/6有直接的关联，而mapk3/6会介导下游hr细胞防御体系，因此可以推测mapk蛋白家族可能参与了oxi1激酶所传递的信号途径。除了病原菌和机械损伤导致植物大量产生的ros诱导oxi1激酶产生之外，低温以及强光胁迫也会直接诱导oxi1激酶的生成，这暗示了叶绿体与oxi1蛋白之间的潜在相关性。[10]同时，当植物在最适宜的生理条件下生长时，在检验植物根系细胞生长时也发现了oxi1的存在，因此oxi1可能还直接参与了植物生长于形态建成的过程。总之，oxi1作为一个关键的蛋白信号分子，在植物整体抗逆境胁迫的信号通路中可能有关键的作用。
2. 研究的基本内容和问题
为了进一步清楚的研究crl突变体的表型与基因之间的关系，本项目选取了crl突变中细胞程序性死亡（pcd）的性状，结合ros在crl中大量存在的情况，推测oxi1激酶在crl突变体之中潜在的作用，尤其是在调控pcd为主要性状的信号通路中的作用。与此同时，进一步对oxi1在crl突变植株的位置进行跟踪，结合oxi1的功能的研究，从多个不同角度对oxi1在crl中的潜在功能进行探究。
crl突变体较wt而言存在许多突变性状，包括叶片外缘卷曲、叶绿体畸形增大、线粒体异化伸长，以及大量聚集的细胞程序性死亡，这种pcd往往是超敏反应导致的细胞凋亡。而有实验证实，在crl突变的pcd及周边组织内发现了大量的ros，因此有研究者推测ros在crl中大量存在的原因是存在与突变植物组织中的pcd，因为同时有研究在植物免疫机制pti中发现，如果植物组织被病原微生物侵入，那么pti免疫系统会激发下游一系列抗病反应，其中一条策略就是ros在短时间内的大量积累。在植物组织中的大量积累的ros，会进一步激活下游的信号因子，其中一个信号分子为oxi1激酶。oxi1激酶是定位在叶绿体基粒膜表面的蛋白激酶，虽然其目前其作用尚不清楚，但是编码oxi1蛋白的基因序列已经得到确认，同时我们已经获得序列信息。
在已知编码oxi1激酶的基因序列的情况下，利用t-dna插入来制造oxi1突变体，在此基础上杂交crl突变体，得到oxi1/crl双突变体以进一步培养并观察双突性状。令人惊讶的是，和crl突变株相比较而言，oxi1/crl双突并没有在pcd表现出太大的差异；进一步利用oxi1-gfp对oxi1/crl回补，和预期的结果完全相反：经过回补的双突的pcd情况更加严重，而不是pcd得到缓解。尽管和预期的结果相反，但是这一现象暗示了，oxi1激酶直接参与到了crl突变的pcd表型的形成过程，但是pcd的形成原因和oxi1激酶在该过程中的功能尚未被研究清楚。因此，针对crl突变，oxi1激酶在引发植物细胞程序性死亡的信号途径中的潜在作用亟待进一步研究。
3. 研究的方法与方案
针对于oxi1激酶的研究与实验主要集中在功能与定位两方面。首先，就oxi1蛋白的定位而言，在已知oxi1序列的基础上，体外人工构建oxi1-gfp基因载体，并利用瞬时基因转化技术将该基因片段导入到烟草之中，在培养经过转化的烟草2-3天后，利用激光共聚焦显微镜对oxi1蛋白的定位进行观察。其次，就oxi1激酶的功能研究而言，我们需要检测并验证在多种胁迫条件下oxi1蛋白的存在，尤其是在h2o2、强光加低温以及茉莉酸的环境条件下。一旦能够检测到oxi1的存在我们会进一步探索oxi1的互作蛋白以及oxi1对各种oxi1或crl等突变株的影响，因为若oxi1激酶在一些信号通路中有关键的传递信号的作用，则一定会有与oxi1互作的蛋白可以被检测。如果能够寻找出oxi1激酶的上游或下游互作的信号因子，我们就可以初步对oxi1所处的信号通路做出假设，同时也会进一步推动叶绿体内膜蛋白功能的解析。
实验方案
4. 研究创新点
就叶绿体内的蛋白研究而言，OXI1蛋白激酶尚未被作为主要的研究对象，这不仅是因为OXI1激酶的首次发现是在植物抗病机理的研究中，而且OXI1和ROS关联也容易被忽视。本实验从单线氧和活性氧的角度出发，结合对造成crl突变中PCD性状的原因猜想，探索OXI1在crl突变中的作用，进一步研究叶绿体内蛋白功能，从而完善叶绿体功能的研究体系。
5. 研究计划与进展
本实验项目从2月底开始进行。根据已有的实验方案计划，结合模式植物生长的周期，本实验的研究将会在4月上旬初步完成实验流程，并进行结果的分析。同期进行中期报告的制作。如果有不理想的实验结果或是缺少应有的实验内容，则在计划5月中旬前完成。同期开始撰写并完善毕业论文，并在5月下旬完成报告，6月上交论文审核并进行终期论文答辩。
在进行OXI1蛋白研究实验的同时，部分基础实验操作训练会同时进行，这些实验主要是围绕EX1蛋白的功能研究。
