mcr-1差异性敏感的肺炎克雷伯杆菌噬菌体ФNJS1的生物学特性及受体鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

肺炎克雷伯杆菌（klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科，在健康人和动物的胃肠道微生物组中天然存在。它是一种条件致病菌，能从临床上进行分离，约占所有革兰氏阴性菌感染的三分之一。其涉及肺炎、败血症、化脓性肝脓肿等危及生命的感染^[1]。在肺炎克雷伯菌中，主要有两种类型，一种是能产生超广谱的β-内酰胺酶（extended-spectrumbeta-lactamases，esbls），对头孢菌素等抗生素具有抗性；另一种能产生碳青霉烯酶，使其对所有的内酰胺类均具有抗性，碳青霉烯类被称为β-内酰胺类抗生素的最后一道防线^[2]。目前，肺炎克雷伯菌这种多重耐药性（multidrug-resistant，mdr）的病原体所导致的发病率和死亡率越来越高，抗生素疗法已完全不能满足于临床治疗且面临着重大挑战。而由噬菌体衍生出的噬菌体疗法有望替代于抗生素疗法，且有研究表明噬菌体和抗生素这两种抗微生物剂的组合在控制病原菌方面比单独使用更有效^[3]。

但是，目前噬菌体疗法应用于治疗肺炎克雷伯菌的感染并不普及，除了需要进行临床功效及安全性评估外，一个最主要的原因就是对噬菌体与多重耐药的肺炎克雷伯菌之间相互作用的机制并不完全了解。而在噬菌体与细菌相互作用的机制中，即噬菌体感染细菌的过程中，最初始的一步就是其能识别并特异性与细菌表面的受体结合。所以，研究噬菌体及其受体，在帮助噬菌体治疗、人类医疗等方面奠定了基础，也对于理解噬菌体-宿主相互作用及噬菌体进化机制具有重要意义。

在自然环境中，噬菌体的数量通常比原核生物的数量多出约10倍, 其中有96以上都属于有尾噬菌体目^[4]。在噬菌体侵染宿主过程中，噬菌体具有严格的宿主特异性和病毒基本特性^[5]。目前，对于细菌上噬菌体作用受体部位和组分的研究也慢慢趋于成熟。在革兰氏阴性菌中，主要有两大类作为噬菌体受体，一是以外膜蛋白为受体，包括λ噬菌体的受体-麦芽孔蛋白（lamb）^[6]、t7 相关噬菌体yep-phi的受体外膜蛋白ail和ompf^[7]、t4 噬菌体的受体ompc^[8]等；一类是以脂多糖（lipopolysacide，lps）为噬菌体受体，如霍乱弧菌的o抗原作为噬菌体vp4的受体^[9]，噬菌体φa1122在鼠疫耶尔森氏菌（yersiniapestis）和假结核耶尔森氏菌（y. pseudotuberculosis）中以lps核心区域作为受体^[10]等。而且噬菌体受体的鉴定方法也逐渐趋于完善，如最常用的构建转座子文库插入突变^[11]、构建目的载体定点插入突变^[10]等，还有研究相关疫苗病毒受体的病毒铺覆蛋白印迹技术（virus overlayprotein binding assay，vopba）^[12],以及近年来通过研究噬菌体尾丝蛋白的相关机制来研究噬菌体受体^[13]等。这些对噬菌体受体的分析和研究，都在进一步挖掘噬菌体在医学和生物技术上的潜在价值。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

旨在研究肺炎克雷伯菌的噬菌体Фnjs1的相关生物学特性，包括吸附率、最佳感染复数等，鉴定其作用的受体基因，为噬菌体治疗肺炎克雷伯菌引起的疾病提供基本依据。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1. 文献调研

2. 实验研究法：噬菌体吸附试验；噬菌体最佳感染复数测定；噬菌体裂解试验；二亲接合法构建转座子插入文库；多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），酶切酶连法构建目的载体；电转法等

3. 数据统计分析法

   技术路线：

实验方案：

1. 测定噬菌体ФNJS1的生物学特性

   1. 噬菌体最佳感染复数的测定

      感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)是指在一个系统中病毒细胞数与细菌总数之比。将处于对数期的肺炎克雷伯菌株A2312用新鲜的LB培养基洗涤3次，将菌液调至10⁹ CFU/ml（OD₆₀₀≈1）。分别以MOI为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，将稀释的噬菌体与菌液均匀混合，在37℃，180 rpm的摇床上振荡培养4~6 h，随后4℃，12000 rpm离心2 min，用注射器吸取上清，用0.22 μm的滤器过滤，将滤液进行梯度稀释，每个梯度10 μl点在A2312的双层琼脂平板上，过夜培养，计噬菌斑数目。每ml中噬菌斑数目最多，即噬菌体滴度最高的，则那一MOI比例为最佳感染复数。

      1.2噬菌体吸附率试验

      以最佳感染复数将终浓度为10⁸ CFU/ml的菌液与稀释的噬菌体混合均匀，分装至2 ml EP（Eppendf）管中，放入37℃水浴，从0 min开始，取3 min、6min、9min的样品，4℃，12000 rpm离心45 s，过滤除菌，梯度稀释点双层琼脂平板计噬菌斑数目，每个时间点三个重复，统计后做噬菌体吸附率曲线。

      2. 转座子插入文库的建立

      2.1 二亲接合建库

      （1）以1的比例用LB液体培养基接种供体菌BW20676（携带转座质粒pRL27，50 mg/l Kan）和受体菌A2312（含有100 mg/l Amp），将试管置于37℃摇床，过夜活化。

      （2）取1 ml各悬液至无菌的2 ml EP管中，12000 rpm离心2 min，弃上清，用无抗的新鲜液体LB洗涤3次，最后再用100 μl重悬供受体菌。

      （3）在不含抗性的LB固体平板上放置了3片已灭菌的0.22 μm的滤膜，分别取供受体菌各20 μl 点于其中两片滤膜上，剩余的供受体菌充分混匀，取50-100 μl点在最后一片滤膜上，静置10 min至无明显液体，将平板正置于37℃培养4-6 h。

      （4）收库：取无菌的2 ml EP管，分别加入1 ml无抗的新鲜液体LB培养基，用无菌的镊子将滤膜挑出，放入EP管中剧烈振荡，使菌体充分振荡下来。

      （5）将接合子菌液稀释至10^-2、10^-3梯度，各取100 μl涂布于双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）固体LB平板上，同时点10-20 μl供、受体菌作为对照，倒置于37℃过夜培养。若接合子生长而作为对照组的菌未生长，则接合成功。

      2.2转座子库保种

      在20mL含有双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）LB培养基的三角瓶里加入成功建库的接合子库菌液，37℃培养过夜。取750 μl扩增后的菌液加入750 μl 50甘油，做好标记，置于-70℃冰箱内保存。

3.噬菌体受体的筛选

3.1 筛选抗性突变株

（1）先将噬菌体在宿主菌中富集，4℃，12000 rpm离心2 min，用0.22 μm的滤器过滤，得到富集的噬菌体。取无菌的5 ml离心管，加入50 μl接合子库菌液与20 μl过滤的噬菌体，37℃孵育15 min后，加入融化的0.6的半固体培养基，上下颠倒混匀倒入双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）固体LB平板上，37℃过夜培养。

（2）取无菌的5 ml离心管，加入1 ml双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）的液体LB，再加入20 μl接合子菌液和20 μl富集的噬菌体，混匀后置于37℃摇床活化2-3 h，随后同样加入半固体培养基，倒双层板，过夜培养，如（1）。

（3）挑取从上层板中长出的单菌落，进行4区划线纯化，纯化后的菌株加入双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）液体LB活化，并保种。

3.2 验证抗性突变株

3.2.1 滴板试验

用牙签蘸取液体活化后的突变株的菌液，在双抗（Amp₁₀₀Kan₅₀）的固体LB平板上划横线宽约0.5 cm，纵向在每条横线上的十字交叉处滴不同梯度的噬菌体5 μl，倒置于37℃过夜培养，并以野生型菌株作为实验对照，观察是否能裂解突变株，且比较噬菌体对二者裂解能力的差异。

3.2.2 吸附率试验

方法同1.2，时间点取0 min、4 min、8min、12min的样品，以野生型菌株作为对照。

3.2.3 裂解试验

分别活化野生型菌株与抗性突变株，以MOI为10^-4的比例混合噬菌体和菌液使菌株终浓度为 OD₆₀₀≈0.2，用新鲜的液体LB稀释噬菌体并加入以配制裂解体系，分装至24孔板中，同时做上不加噬菌体的对照，每一体系至少两个重复，置于37℃培养箱，每30 min测一次OD₆₀₀，测至120 min，并取0 min、60 min、120 min的样品，过滤除菌，计噬菌体的数目，即PFU。

3.3 确定转座子插入位点

3.3.1 提取抗性突变株基因组DNA

（1）挑取单菌落至液体 LB 培养基中，37℃ 180 rpm 摇床振荡过夜培养，将菌液转移至2 ml EP管中，11000 rpm离心2 min，弃去上清液保留沉淀。

（2）将菌液重悬于100 μl 4℃存放的溶液Ⅰ中，剧烈振荡使菌充分悬浮，冰浴2-5 min。

（3）加入100 μl新配制的溶液Ⅱ（880 μl ddH₂O 20μl 10 M NaOH 100 μl 10 SDS）,缓慢颠倒EP管数次，至溶液变粘稠，冰浴5 min。

（4）加入100 μl 4℃存放的溶液Ⅲ，剧烈振荡EP管数次，此时能看到白色絮状沉淀，冰浴2-5 min。

（5）加入2-3滴氯仿，10000 rpm离心10 min。

（6）将上清液取出转移至新的2ml EP管中，加入等体积的苯酚/氯仿抽提12000g离心10min(此步骤重复2遍)

（7）将上清液转移至新的1.5 ml EP管中，加入3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，颠倒混匀后竖直放入-70℃，15-20 min。

（8）12000 rpm离心10 min，小心弃去上清，用1 ml 75的乙醇洗涤沉淀3次，并待沉淀风干，加入20 μl ddH₂O溶解基因组DNA。

3.3.2 随机引物PCR

利用提取的基因组DNA为模板进行随机引物PCR，通过测序和序列比对，确定转座子插入位点。

4.高碘酸盐和蛋白酶K处理试验

先将菌株在TSB培养基中液体活化，用新鲜的液体TSB培养基洗涤2次，菌浓度调至10⁹ CFU/ml。在1.5 ml的菌液中以12000加入蛋白酶K（600 mAnson U/ml，Takara）37℃恒温水浴1-2 h，做上不加蛋白酶K的对照，随后用液体TSB将处理后的菌液洗涤3次，调整菌液浓度，做噬菌体吸附实验，比较吸附率。

为探究高碘酸盐（一种强氧化剂，能破坏脂多糖）对噬菌体受体的影响，将1.5 ml洗涤后的菌液12000 rpm离心2 min，用1.5 ml的高碘酸钠（1mM乙酸钠 10mM高碘酸）悬浮沉淀的菌体，室温避光放置1 h左右，用液体TSB洗涤3次，重悬菌体调至一样的菌浓度，最后进行噬菌体吸附测定。

5．构建插入失活突变株（单交换）

5.1构建重组质粒

5.2 电转化法制备供体菌

将构建好的重组质粒电转入大肠杆菌S17-1或 BW20676中。将质粒和电转杯置于冰上预冷5 min，从-70℃中取出这两种大肠杆菌的感受态，待在冰上融化后，吸取2-3 μl质粒加入感受态中，吹打混匀后一起转入电转杯（规格200 μl）中。调节电压至1600 V，电转5 ms。用800 μl液体LB培养基将电转杯中的液体一起转移至2 ml EP管中，37℃摇床孵育1 h，吸取100-200 μl涂布于相应抗性的LB固体培养基，剩下的菌液离心后重悬，并涂布，放于37℃过夜培养。挑单菌落进行PCR验证，为阳性则供体菌制备成功。

5.3 二亲结合

5.4 验证插入失活突变株

可行性分析：

1.肺炎克雷伯菌和噬菌体的繁殖周期短，适合进行相关分子实验。

2.实验室在病原菌互作研究方面技术成熟，发表过多篇相关的SCI论文，实验室的科研经验足以保证这项研究的顺利进展。

3.申请人具备科研素质和一定的实验技能，对研究目标、研究内容等有清晰准确的认识，为实验的顺利进行奠定了基础。

4. 研究创新点

特色或创新之处

（1）对于肺炎克雷伯杆菌中噬菌体及其受体的研究并不多；

（2）此噬菌体Фnjs1其能够感染并裂解32株中的15株肺炎克雷伯菌，包括atcc baa1706的标准菌株、肺炎克雷伯菌株a2312等，有一定宿主范围，对于发现保守受体奠定了一定理论基础。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

2018年8月——2018年9月：熟悉相关实验操作，查阅文献，拟定实验计划。

2018年10月——2018年12月：建立转座子库，构建重组载体。