1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1 课题意义
昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes, epns）是一种体内携带共生菌的昆虫寄生性线虫，包括斯氏线虫科 (steinernematidae) ,异小杆线虫科(heterorhabditidae)和小杆科（rhabditida)，因其具有寄主广泛，安全无污染，且容易大量生产，不易产生抗性等特性而作为一种环境友好的生物防治因子。epns的繁殖和发育是影响商品价值的重要因素。研究调控线虫生长发育的基因可以有针对的对线虫进行改良，提高其商业、实用价值。
1.2 研究概况
2. 研究的基本内容和问题
2.1 研究目标、内容
构建lin-41 rnai干扰片段的克隆载体，通过饲喂的方式敲低lin-41基因的表达量，通过rt-pcr的方法确定对线虫干扰成功。
2.2 拟解决的关键问题
3. 研究的方法与方案
3.1 研究方法
取大蜡螟活体培养的DZ怀卵大母虫制备无菌卵，收集到大量DZ/S1的单菌线虫。同时进行lin-41RNAi干扰片段克隆载体与lin-41RNAi干扰片段表达载体的构建与鉴定。用饲喂的方法使线虫体内目标基因的表达量降低。
3.2 技术路线
3.3 实验方案
3.3.1 单菌线虫的制备
倒LB固体平板，取保存于-70℃的嗜线虫沙雷氏菌S1，在超净工作台中划S1单菌板，在37℃恒温培养箱中培养24-48h，平板倒置放置。挑取过夜培养的S1单菌落于新鲜LB液体培养基中，37℃180g培养6-8h。用无菌接种环沾取S1株菌的培养液于肝-琼脂培养基平板上划田字格，在30℃恒温培养箱中繁殖1-2d，平板倒置放置。
取大蜡螟活体培养的DZ怀卵大母虫制备无菌卵。收集怀卵大母虫，用300-400目的网筛过滤除去幼虫，收集过滤后的怀卵大母虫于5ml无菌离心管中，用无菌自来水清洗一遍，3500g离心2min，重复上述清洗过程2遍。加入0.2%硫柳汞钠溶液浸泡30-40min，或者加入硫柳汞钠后剧烈摇晃15s并重复3次，进行大母虫体表消毒。加入线虫裂解液进行裂解和消毒，一遍剧烈震荡，一边观察大母虫裂解情况，待虫卵释放后，4500g离心2min，去上清。用无菌自来水清洗两边获得的无菌卵。将获得的无菌卵稀释至合适浓度，接种到培养好的肝琼脂培养基上，正置于线虫培养箱中培养。培养7d后就可以收集到大量DZ/S1的单菌线虫。
3.3.2 lin-41干扰片段的克隆载体构建和鉴定
3.3.2.1 设计RNAi引物并以DZcDNA为模板，用RNAi引物扩增目的片段。PCR反应体系（25μl）和程序如下：
| 体系成分 | 加样量 |
| Premix TaqTM ddH2O 上游引物 下游引物 模板 cDNA | 12.5 μl 8.5 μl 1 μl 1 μl 2 μl |
PCR程序设定：94℃预变性4min；94℃变性1min；62℃退火1min；72℃延伸40s；72℃终延伸10min；15℃暂时保存。其中第2步到第4步重复35个循环。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并按照试剂盒步骤操作，对目的片段进行胶回收。
3.3.2.2 大肠杆菌DH5α的感受态制备
由本实验室保存的DH5α制备感受态，具体操作如下：
1) 将-70℃保存的DH5α菌种划LB固体培养基单菌板，37℃倒置过夜培养；
2) 挑取单菌落，接于2mlLB液体培养基中，过夜培养；
3) 按1:100比例，取0.5ml过夜培养液转接入50ml新鲜LB培养基中，37℃
200-280g摇2-3h至OD600达到0.4左右；
4) 将菌液用预冷的无菌1.5ml离心管进行分装，于冰上静置10min；
5) 加入1ml0.1M的冷Cacl2，混匀后冰上放置25min；
6) 4000g 4℃离心10min，弃上清，倒置在无菌吸水纸上2min；
7) 重复步骤5和6；
8) 每管加入30μl冷0.1M Cacl2和等体积的30%甘油，混匀后保存与-70℃。
3.3.2.3 RNAi目的片段连接T-Vector pMD19（Simple）并转化到DH5α感受态
1) 在微量离心管中配制如下反应体系（5μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| T-VectorpMD1（Simple） lin-41RNAi 片段 ddH2O | 1 μl 1 μl 3 μl |
2) 上述反应液中加入等体积5μlDNA Ligation Kit（SolutionⅠ），充分混匀；
3) 16℃连接30min；
4) 全量10μl反应液中加入1μl SolutionⅢ，混合后加入到100μl DH5α感受态
中轻柔混匀，冰浴30min；
5) 42℃水浴45s后迅速转入冰中放置1min；
6) 加入790μl LB液体培养基，37℃震荡培养1h；
7) 取100μl转化液涂布于含有适量Amp的LB固体平板上，37℃倒置培养；
8) 挑选单菌落进行菌落PCR。
3.3.2.4 阳性克隆载体转化子的质粒提取
1) 挑取阳性转化子于1-4mlAmp抗性LB液体培养基中37℃过夜培养；
2) 过夜培养液12,000g离心2分钟，弃上清；
3) 用250μl SolutionⅠ（含RNaseA）充分混匀和悬浮菌体；
4) 加入250μl SolutionⅡ，缓缓翻转混合5-6次，充分破碎菌体细胞，直至成透明混合液；
5) 加入350μl预冷的SolutionⅢ，缓缓翻转混合5-6次，至出现白色紧实的聚集块，于室温下静置2min；
6) 室温12,000g离心10min，取上清；
7) 将Spin Column置于Collection Tube上，并将6步骤中的上清液转移至Spin Column中，12,000g离心1min，弃滤液；
8) Spin Column中加入500μl Buffer WA，12,000g离心30s，弃滤液；
9) Spin Column中加入700μl Buffer WB，12,000g离心30s，弃滤液，重复此步骤1次；
10) 12,000g 1min空离Spin Column；
12) 将Spin Column置于无菌1.5ml离心管上，在Spin Column膜中央加入50μl预热到60℃的ddH2O或者Elution Buffer，室温静置1min；
13) 室温12,000g离心1min洗脱质粒。
14) 将获得的lin-41基因RNAi片段克隆载体送华大基因测序。
3.3.2.5 克隆载体质粒的双酶切和测序鉴定
1) 在微量离心管中制备如下体系（20μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| 10×QuickCut Buffer lin-41克隆载体质粒 KpnⅠ SacⅠ ddH2O | 2 μl 10 μl 1 μl 1 μl 6 μl |
上述反应体系在37℃下双酶切1-2h。
2) 对上述反应液进行琼脂糖凝胶电泳，验证克隆载体转化子正确性；
3) 胶回收验证正确的双酶切目的RNAi片端，步骤同上。
3.3.3 lin-41RNAi干扰片段的表达载体构建和鉴定
3.3.3.1 L4440质粒KpnⅠ和SacⅠ双酶切
1) 在微量离心管中制备如下体系（50μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| 10×QuickCut Buffer L4440 质粒 KpnⅠ SacⅠ ddH2O | 5μl 25 μl 1.5 μl 1.5 μl 17 μl |
上述反应体系在37℃下双酶切1-2h。
2) 上述反应液进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的L4440双酶切片段，步骤同上。
3.3.3.2 HT115（DE3）感受态的制备（一步法）
1) 在Tet抗性LB平板上划HT115（DE3）的单菌板，37℃倒置培养；
2) 挑取单菌落至4ml LB液体培养基中过夜培养；
3) 按1:100比例，吸取500μl培养液到50ml新鲜LB液中，37℃ 225g震荡培养2-2.5h至OD600为0.3-0.4；
4) 将50ml培养液转移至10ml离心管中，冰浴15-30min，4℃ 4000g离心10min，弃上清；
5) 加入1/10体积的1×TSS（1ml）重悬细胞，冰上放置5-15min；
6) 按100μl每管分装至预冷的1.5ml离心管中，-70℃保存。
3.3.3.3 RNAi目的片段连接L4440质粒并转化到HT115（DE3）感受态
1) 微量离心管中制备如下体系（10μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| L4440 双酶切片段 lin-41RNAi 片段 ddH2O | 3 μl 6 μl 1 μl |
2) 上述反应体系中加入等体积10μl DNA Ligation Kit（SolutionⅠ），充分混匀；
3) 16℃连接30min；
4) 20μl总液中加入2μl SolutionⅢ，混合后加入到100μl HT115（DE3）感受态中，轻柔混匀，冰浴30min；
5) 42℃水浴45s后迅速转入冰中放置1min；
6) 加入778μl LB液，37℃震荡培养1h；
7) 取100μl涂布于Tet和Amp双抗LB平板，倒置于37℃培养；
8) 挑选长出的单菌落进行菌落PCR。
3.3.3.4 表达载体质粒的双酶切和测序鉴定
1) 微量离心管中制备如下体系（20μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| 10×QuickCut Buffer lin-41表达载体质粒 KpnⅠ SacⅠ ddH2O | 2 μl 15 μl 1 μl 1 μl 1 μl |
上述反应体系在37℃双酶切1-2h。
2) 上述反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测表达载体转化子正确性；
3) 并按之前步骤提取表达载体质粒，送华大基因测序。
3.3.4 lin-41dsRNA的表达
参考前人方法，用IPTG诱导HT115（DE3）-L4440-lin-41表达载体质粒菌，具体步骤如下：
1) 将构建好的阳性表达载体划Tet/Amp双抗LB单菌板，于37℃倒置培养；
2) 挑取单菌落于Tet/Amp双抗LB液体培养基中，培养6-8h；
3) 吸取500μl培养液接种于新鲜50ml Tet/Amp双抗LB液体培养基中,培养至OD600达到0.4左右，加入TPTG至终浓度400mM，继续培养3-4h；
4) 取1-3ml培养液，12,000g离心5min，弃上清；
5)v加入200μl 1M醋酸钠和10mM EDTA，65℃热处理1h；
6) 加入200μl酚:氯仿（1:1），涡旋均匀，13,000g离心2min；
7) 取上清，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的5M Nacl，混匀，13,000g离心5min，弃上清，获得总核酸；
8) 75%乙醇洗涤总核酸，加入适量ddH2O溶解总核酸；
9) 用DNaseⅠ和RNase A处理总核酸，除去DNA和ssRNA，在微量离心管中制备如下反应体系：
| 体系成分 | 加样量 |
| 总核酸 10×DNaseⅠbufferr DNaseⅠ RNase A ddH2O | 20-50 μg 5μl 2 μl（10 units） 1 μl（20 units） Up to 50μl |
上述反应体系在37℃下反应1h
10） 上述反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测dsRNA的诱导表达。
3.3.5 实时定量PCR检测RNAi线虫lin-41相对表达量
3.3.5.1 lin-41RNAi实验分组
利用构建好并验证正确的lin-41dsRNA表达载体进行RNAi实验。实验中分为4组，分别如下：
RNAi实验组：分别用终浓度0μM和100μM的IPTG诱导lin-41dsRNA表达载体。获得的相应NGM发酵液分别饲喂同期化的DZ L1期幼虫。
空载体对照组：用终浓度100μM的IPTG诱导含有L4440空载质粒的HT115（DE3）菌株。获得的NGM发酵液饲喂同期化的DZ L1期幼虫。
将上述不同处理组的DZ L1幼虫在线虫培养箱培养3天左右，每组取500条进行总RNA提取和反转录，进行荧光定量PCR。
3.3.5.2 lin-41和管家基因（18s）的荧光定量引物设计
对DZ lin-41和18s基因进行同源序列分析后，选取跨内含子且同源性较低的片段为定量片段。
3.3.5.3 实时定量PCR扩增
定量扩增使用康为世纪的UltraSYBR Mixture (Low ROX)，在ABI公司的Stepone Real-Time PCR System上进行。96孔荧光定量板中反应体系如下（每孔加样量20μl）：
| 体系成分 | 加样量 |
| 2×UltraSYBR Mixture (Low ROX) 上游引物 下游引物 模板 cDNA ddH2O | 10 μl 0.4 μl 0.4 μl 2 μl 7.2 μl |
定量PCR程序设定：预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s；退火延伸60℃ 1min；第二步和第三步进行40个循环；溶解曲线分析：95℃ 15s；60℃ 1min；95℃ 15s；60℃ 15s。
以18s内参基因对每组lin-41表达量进行均一化处理。采用2-ΔΔCt相对定量法计算每组lin-41的相对表达倍数。使用 Graphpad prism5 进行数据分析和作图。
3.4 可行性分析
这项课题的确立有较充分的科学依据，有前辈们的技术支撑，并且社会经济价值高，可以与生产密切结合。本课题所属实验室具有丰富的线虫研究经验，研究过程中所用的研究方法有大量实践支撑，可以在实践中灵活运用。同时实验中，导师、师姐的指导帮助在实验的顺利进行中发挥着重要的作用。
4. 研究创新点
4.特色或创新之处
本实验的创新之处在于，通过构建RNAi原核表达载体，降低崇明拟异小杆线虫体内lin-41基因的表达量
5. 研究计划与进展
5. 研究计划及预期进展
2018.8-2018.11 查找翻阅该实验相关材料，初步制定实验方案，熟悉并熟练使用与实验相关的各项仪器、掌握培养基配制方法，饲养实验用线虫，进行前期准备工作。
2018.12-2019.1、2019.3-2019.4 按照实验计划进行操作，基因干扰片段克隆载体的构建和表达，及其鉴定，检测rnai线虫lin-41相对表达量。根据实际情况调整实验方案。进行开题报告，中期报告。
