酿酒酵母 Vps72 缺失对细胞自噬的影响开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题研究意义

自噬是真核细胞的基本功能，它对维持细胞内生理平衡起着关键作用。自噬现象不管从酵母到人类都具有良好的保守性。自噬过程可分为自噬的诱导、自噬小体的形成和自噬体的运输和裂解这三个阶段。而在自噬体的运输和裂解这一过程中，液泡参与其中。自噬体运输至液泡附近，其外膜与液泡膜相融合，内膜及包含物进入液泡，形成自噬小体，再通过液泡中的水解酶进行降解。通过筛选具有自噬缺陷的酵母突变体，已经发现了很多与自噬现象有关的基因（apg，aut，cvt，gsa，pag，paz和pdd），为了统一名称便将这些基因名称统称为atg基因（自噬相关基因）。到目前为止已报道了40多种atg基因^[7]。

2. 研究的基本内容和问题

4.研究的目标、内容和拟解决的关键问题

构建VPS72基因敲除的GFP-Atg8标记酵母，通过荧光观察，对比野生型与突变型表型差异，同时利用常规分子生物学手段检测自噬相关蛋白含量的变化。在本研究中，需解决的关键问题是在GFP-Atg8标记的酵母中成功敲除VPS72基因，从而获取基因敲除酵母。

3. 研究的方法与方案

5.研究方法

5.1通过gfp-atg8单荧光自噬指示体系：

利用atg8在自噬形成过程中发生聚集的原理的gfp-atg8指示技术：无自噬时，gfp-atg8融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，gfp-atg8融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot检测游离的gfp来验证。

4. 研究创新点

5. 研究计划与进展

9.研究计划及预期进展

2018.10 - 2019.1阅读有关文献，同时进行相关实验，并获得突变酵母菌株；

2019.2 - 2019.5深入学习并研究掌握相关实验技能，并对突变株与野生型进行表型对比检测；