水稻田中嗜甲烷菌的分离和筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题的研究意义

甲烷是天然气、沼气、油田气及煤矿坑道气的主要成分，是第二大温室气体（近200多年来，大气中的甲烷含量急剧增加，对全球变暖的贡献量为20%）。因此，甲烷的开采、生成、转化和排放关系着能源、化工和环境等一系列重要问题，是全球关注的热点。甲烷的生成和氧化是自然界碳素循环的重要环节。一些微生物利用CO₂生成CH₄，而另一些则能将CH₄转化为生物量和CO₂。甲烷氧化过程主要由嗜甲烷细菌（MethanotrophicBacteria，MB）完成，环境中的甲烷在厌氧生境中由产甲烷细菌形成后，经土壤和水层，逸散入大气，在途经土壤和水层时可被栖息于其间的MB所氧化，土壤中MB氧化作用，大约占大气甲烷消耗量的10%^，本研究主要着眼于水稻田中的甲烷氧化菌，水稻是大气甲烷的重要生物源之一，每年约有60Tg甲烷从稻田排放到大气，占全球总排放12%。因此，控制和减少稻田土壤的甲烷排放量，也即在控制和减少稻田土壤甲烷形成量的同时，加强和促进土壤中的甲烷氧化速率，对降低温室效应的贡献是极其重要的。在目前尚无更好的措施减少甲烷形成量的前提下，进行了以下研究:本研究目的之一旨在从水稻土壤中选育出甲烷氧化菌的优势菌株，以这个作为研究起点，为以后的相关研究准备好良好的样本。

2 国内外主要进展

2.1大气甲烷的源与汇

根据IPCC(2007)估测稻田甲烷的年释放量可达60Tg,约占甲烷总源的12%(如表1)。而全球土壤对大气甲烷的吸收占总汇的6%，其吸收量为30Tg/yr，因此土壤特别是稻田土壤在全球甲烷循环中起着相当重要的作用。

表1 大气中甲烷的源与汇(摘白IPCC,2007)

Table 1 Estimated sources and sinks ofmethane in the atmosphere (adapted from, 2007)

续表1 Table 1

土壤消耗甲烷的作用不仅仅体现在它对大气中甲烷的消耗，更重要的在于其对自身产生的甲烷消耗，即土壤对内源甲烷的消耗。土壤对甲烷的吸收主要是由于甲烷氧化菌的存在。环境中的甲烷在厌氧生境中的产甲烷细菌形成以后，要途经土壤和水层，才逸散入大气，在途经土壤和水层时可被栖息于其间的甲烷氧化菌所氧化。据IPCC(2007)估计，全球土壤每年消耗约30Tg甲烷，相当于大气甲烷总汇的6%，但是不同的生态系统土壤对甲烷;的消耗速率有较大的差异(如表2)

表2不同生态系统土壤消耗甲烷的速率(mg/ (m*d) )(摘白IPCC,2007)

Tahle 2 Rate of methane depletion in soilsof different ecosystems(adapted from,2007)

稻田土壤即使在淹水条件下也并不均匀地处于还原状态，水稻根系分泌出氧而在根系周围形成氧化层，大气氧在水层中的扩散，使在水土界面形成很薄的氧化层。这些区域为甲烷氧化菌的生长提供了条件。当土壤中生成的甲烷通过扩散进入氧化区域时，大量甲烷被甲烷氧化菌吸收消耗。稻田土壤厌氧环境下生成的甲烷在排放到大气中之前被吸收的比例高达20%-90%，因此甲烷氧化菌是土壤吸收甲烷的主要贡献者，在全球甲烷消耗中起着重要的作用。而且它在水陆环境中的碳、氧、氮循环中也起着重要的作用，甲烷氧化菌在生产单细胞蛋白和新功能酶方面也体现出极大的潜力，近年来由于发现其具有降解一些环境污染物如三氯乙烯(TCE)的能力愈发引起人们的兴趣。因此，对稻田土壤甲烷氧化的影响因素及甲烷氧化细菌特性研究，有着重大的意义。

2.2甲烷氧化菌的生态分布

运用富集培养和现代分子生物学手段，从农田、森林、草地、垃圾填埋厂、湖泊、沼泽、地下水、海洋等各个环境中的土壤或水样中检测到甲烷氧化菌的存在。现存的甲烷氧化菌大多数为喜中性菌，但在许多极端环境中如高温、高酸、高碱、高盐的条件下也检测到专性甲烷氧化菌的存在。为了在极端条件下存活，甲烷氧化菌进化了各种结构与功能适应性机制。有研究者认为，极端环境中甲烷氧化菌的生理作用是参与甲烷循环和为环境中别的微生物区系提供一碳中间物和各种代谢底物。大多数甲烷氧化菌具有休眠状态，一些甲烷氧化菌的外生饱子和饱囊在干旱和营养缺乏的环境下似乎适应和存活得很好。

3 应用前景

甲烷氧化菌在自然界中普遍存在，他们能氧化大部分厌氧环境中产生的甲烷，上壤对甲烷氧化作用之大，每年消耗约30Tg甲烷，相当于大气甲烷总汇的6%，其在全球甲烷的平衡中起着重要的作用，从而在调节全球气候变暖中的作用是不可忽视的。由于其在全球碳循环中所担负的重要作用和在生物降解方面的巨大潜能引起了微生物学家的广泛关注，甲烷氧化菌含有代谢一碳化合物的酶系，例如其甲烷单加氧酶能在常温常压下将乙、丙烯氧化成环氧乙、丙烷，我国工业上生产环氧丙烷采用氯醇法，该法缺点除原料成本和能耗较高以外，还存在氯化烃类污染环境的问题，再者，甲烷单加氧酶是一个非专一性的诱导酶，能使正烷氧化成醇，使醋、环烃、芳香化合物和杂环化合物羚化，使CO氧化成C02，所以在治理环境污染方面有潜在的应用价值。

参考文献：

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2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

（1） 通过取自水稻田中的土壤样品，分离出预期甲烷氧化菌；

（2） 对分离出的甲烷氧化菌进行16srna鉴定，确定种属。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法

1.1 实验材料

甲烷氧化菌筛选所用的NMS2培养基，是以甲烷或甲醇为碳源，培养温度为30℃。

NMS2培养基母液：

10×NMS2（400ml）：MgSO4·7H2O 0.8g，Cacl2·2H2O 0.056g（定容后加入），Nacl 30g，KNO3 4g

20×P（200ml）：KH2PO4 1.088g，NaH2PO4·12H2O （50ul浓盐酸调pH）

1M CB（400ml）：NaHCO3 23.52g，Na2CO3 12.72g （过滤除菌）

NMS2培养基：10×NMS2 10ml、CB 5ml、20×P 2ml、金属离子（Cu2＋）200ul、去离子水90ml、Kan50 60ul（若液体培养，加入碳源甲醇500ul/100ml）

琼脂糖培养基：琼脂糖 1.3g、去离子水90ml

pH7.5磷酸钾缓冲液：KH2PO4 0.245g，K2HPO4 1.872g、去离子水 100ml

稻田土壤：取自学校周边水稻田

1.2 16SRNA鉴定

细菌培养液

基因组DNA

连接克隆载体

16S rDNA片段

阳性克隆鉴定

16SrDNA片段

片段回收 测序

2 技术路线及实验方案

3 可行性分析

有工作基础、实验条件良好，具备完成本实验研究内容那个所必备的理论知识和技术。本人所在的实验室拥有先进的科研设施、实验平台，并建立了微生物学相应的先进实验技术体系。

4. 研究创新点

借助最新发现和开发的优良研究材料与高效研究方法，从水稻田中分离出甲烷氧化菌，为进一步研究甲烷氧化菌转化甲烷的内在分子机制打下坚实基础，并对以后对甲烷氧化菌的遗传改造和工业化应用打好基础。

5. 研究计划与进展

2018年11月-2017年12月 采集土壤样本；

2019年1月-2019年 2月 甲烷氧化菌筛选

2019年3月-2019年4月 甲烷氧化菌纯化；