植物促生菌在增强柳枝稷耐镉性中的作用开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

过去数十年以来，由于工农业的快速发展，如矿产开发、污水灌溉、杀虫剂滥用及化肥过度施用，导致农田土壤及水源受到污染，其中重金属污染成为全球面临的环境问题之一（Alves等，2017）。2014年国家环境保护部和国土资源部的全国土壤污染调查报告显示：全国土壤无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8%，其中镉（Cd）被鉴定为一种主要的无机污染物，其位点超标率达7.0%（Zeng等，2017）。镉在土壤中具有较强的移动性，易被作物吸收并在可食部位积累，这不仅影响作物产量和品质，还可通过食物链给人类健康带来潜在威胁（McLaughlin等，1999）。因此，农田土壤镉污染修复刻不容缓。目前，因治理重金属污染土壤的物理、化学方法成本高且容易给环境带来二次污染，不易大面积推广，而成本低廉、环境友好植物修复技术受到广泛关注（Quartacci等，2006）。然而，用于修复重金属污染土壤的超积累植物因生长缓慢、生物量低，植物体难以回收利用等问题限制了其在实际中的应用（Vetterlein等，2009）。

植物根际促生细菌（PGPR）是生活在植物根际的一类能促进植物生长、防治植物病害、提高农作物产量的有益细菌（Bashan等，2005）。目前已经报道的根际促生菌主要包括芽孢杆菌属、肠杆菌属、假单胞杆菌属等（能凤娇等，2013）。植物根际促生菌可通过分泌生长素、1-氨基-1-羧基环丙烷脱氨酶（ACC）以及溶磷作用等促进植物的生长（Kamnev等，2000），增加其生物量；还可以通过分泌有机酸、生物表面活性剂等提高土壤中重金属的生物有效性来增加植物对重金属的吸收量，从而提高植物修复效率（Ma等，2009）。近年来，应用植物联合微生物修复重金属污染土壤取得重要理论成果，已经证明对油菜（Brassica napusL.）、玉米（Zea maysL.）等接种植物根际促生菌均可提高其对重金属胁迫的耐受性（张艳峰，2011），但田间应用仍相对匮乏。

柳枝稷（Panicum virgatumL.）,属于禾本科（Gramineae）黍属（Panicum）,是起源于北美洛基山脉以东、北纬55°以南大草原的高秆多年生草本C4植物 ,通常被用于放牧、水土保持以及生态建设等（黄黔，2008）。由于柳枝稷适应性强,具有较高的产量潜力和较强的耐旱耐脊能力, 对环境友好,能够用于生产能源,因此国内外许多学者认为柳枝稷是一种具有较大发展潜力的能源作物（Sanderson等，1996）。本研究试图利用植物根际促生菌增强柳枝稷吸收积累镉的能力，旨在为利用和修复重金属污染土壤、避免与粮饲争地、在重金属污染土壤上开发能源植物提供可行的调控途径。

参考文献

黄黔.我国的生态建设与生态现代化[J].草业学报,2008,17(2):1-8.

能凤娇，刘鸿雁，马莹，等.根际促生菌在植物修复重金属污染土壤中的应用研究进展[J].中国农学通报,2013,29(5):187-191.

张艳峰.金属耐性植物内生细菌对油菜耐受与富集重金属的影响极其机制研究[D].南京：南京农业大学,2011:43-59.

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Quartacci M F，Argilla A，Baker A J M，et al.Phytoextraction of metals from a multiply contaminated soil by Indian mustard[J].Chemosphere,2006,63:918-925.

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Zeng L，Zhu T，Gao Y，et al.Effects of Ca addition on the uptake,translocation,and distribution of Cd in Arabidopsis thaliana[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,2017,139:228-237.

研究的目标、内容和拟解决的关键问题

1 研究内容

（1）供试菌株为本实验室自主筛选出来的三株耐镉植物根际促生菌，分别为：Ma02、Ls01、Pi01；植物材料为柳枝稷Alamo品种。通过水培实验，探究镉胁迫下外源施加植物根际促生菌对柳枝稷镉吸收积累的影响。

（2）镉胁迫下外源施加植物根际促生菌，增强柳枝稷镉耐性的生理功能研究。

2 研究目标

（1）明确镉胁迫下植物根际促生菌对柳枝稷镉吸收积累的影响。

（2）从供试菌株中筛选具有明显促进柳枝稷吸收积累镉的植物根际促生菌菌株。

3 拟解决的关键问题

阐明植物根际促生菌具有调控柳枝稷吸收积累镉的能力，为柳枝稷耐镉性调控研究提供新的思路。

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

1 研究方法

1.1实验设计

1.1.1菌液制备

菌株选取Ma02、Ls01、Pi01三种菌株。菌液制作过程为：①挑单菌至20ml液体LB中，30℃，220rpm振荡10小时。②将20ml摇好菌液超净台中转移至灭菌50ml离心管中。③室温，6000rpm离心5min。④弃上清，加无菌水约30ml，吹打混匀。⑤室温，6000rpm离心5min。⑥弃上清，加无菌水约30ml，吹打混匀。⑦室温，6000rpm离心5min。⑧弃上清，加无菌水稀释，约加至45ml时测OD₆₀₀值。⑨用无菌水调OD₆₀₀值至1.0。⑩每个盆钵加6mlOD₆₀₀=1的菌液。

1.1.2种子萌发

选取大小类似，均匀饱满的Alamo品种柳枝稷种子于50%的硫酸中27℃,200rpm振荡30min，用去离子水冲洗多次直至冲洗干净，然后将柳枝稷种子浸泡在10%NaClO溶液中10min，用去离子水冲洗干净，播于铺有湿润试纸的培养皿(直径为9cm) 中发芽1周，再将发芽后的苗转移到装有清洁石英砂的方形盆中，置于温度为25~32℃，湿度50%~70%，光照时长为12 h的培养室中进一步生长。待柳枝稷至1叶1心时，选择大小健康状况一致的幼苗移入装有1升1/4Hoagland营养液的塑料盆（22 cm×16 cm×7.5cm）中，适应生长1周后，换为1/2Hoagland营养液继续培养。当柳枝稷长至5叶1心时进行CdCl₂处理，对柳枝稷的Cd浓度设为20μmol/L。对每个品种柳枝稷设对照、Ma02、Ls01、Pi01四个处理，在每个处理中设置三个重复，一周更换两次营养液。为了降低边缘效应的影响，每天调整盆钵的位置。Cd处理两周后，进行取样。

1.1.3营养液配方

营养液配方为：5mmol L^–1Ca(NO₃)₂，5mmol L^–1 KNO₃，1mmol L^–1KH₂PO₄，2mmol L^–1MgSO₄，25μmol L^–1Fe-EDTA-Na₂，50μmol L^–1H₃BO₃，0.3μmol L^–1CuSO₄5H₂O，4.5μmol L^–1MnSO₄H₂O，3.8μmol L^–1ZnSO₄7H₂O 和0.1μmol L^–1(NH₄)₆Mo₇O₂₄4H₂O。用HCl或NaOH溶液将营养液的PH调至5.8。

1.2测定方法

1.2.1生物量测定

首先测定各处理条件下柳枝稷的株高。然后小心取出植株样品，先用20mm·L^-1的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液洗脱根系上的重金属离子，再用去离子水对植株根系进行反复地冲洗后，用滤纸把水吸干。将植株地上部分以及地下部分分开后，分别测定其鲜重，然后将柳枝稷鲜样置于105℃的烘箱里杀青30min后，60℃下烘48h，测定植物干重。

1.2.2根系形态特征扫描分析

取样时将根和地上部分离，完整的根系立即放入装有去离子水的透明方形盘中，充分分散开，使根系之间无交叉、重叠，完整的根系平铺在盛有去离子水的托盘（30 cm×40 cm）中，使根系分散开来。为了避免根系交叉，较大较多的根系被分开扫描。用EPSON扫描仪扫描形成电子图片，用根系分析软件[WinRHIZO software (V5.0, Regent Instruments, Quebec, Canada Inc.)]分析出总根长(Total root length, RL)、根表面积(Root surface area, RA)、根体积(Root volume, RV)、根系平均直径(Average root diameter, RD)、根尖数(Number of root tips, RT)等根系形态参数及根系构型数据。

1.2.3叶绿素含量测定

取新鲜植物叶片，去离子水清洗干净后用滤纸吸干，剪碎后称取0.2g放入15mL的试管中，加入10mL 95%乙醇提取液，至于黑暗条件下，静置提取48h，待叶片发白后，取上清液于比色皿中，空白对照为95%的乙醇，用分光光度计分别在665 nm、649 nm﹑470 nm条件下测定不同色素的吸光值。计算公式如下：

Chl_a= 13.95A₆₆₅-6.88A₆₄₉

Chl_b= 24.96A₆₄₉-7.32A₆₆₅

Car=（1000A₄₇₀-2.05C_a-114.8C_b）/245

叶绿素含量（mg·g^-1）=（C*V*N）/W*1000

注：C为色素含量（mg·L^-1）；V为提取液体积（mL）；N为稀释倍数；W为样品鲜重。

1.2.4重金属含量测定

先将消煮管用去离子水清洗干净，再用10%的HNO₃溶液浸泡24h，清水冲洗干净后用去离子水润洗，置于烘箱内烘干备用。取1.2.1中测定过干重的柳枝稷地上部分和地下部分样品于消煮管内，加入8 ml HNO₃-HClO₄（V:V=85:15）的混合液浸泡植物样品，进行冷消煮12 h，再用消煮炉消煮至干，用2.5%的HNO₃溶液定容至10mL，70℃水浴溶解30 min后，用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定柳枝稷地上部分和地下部分的镉离子浓度。

1.2.5数据处理

利用Excel 2007进行数据整理，SPSS 20.0进行方差分析，采用Duncan法进行显著性分析。

2 技术路线

见附件

3 可行性分析

本人所在实验室前期进行耐镉胁迫的柳枝稷种质资源筛选，得到生物量较高的柳枝稷品种Alamo；本室前期实验中已在一年生黑麦草上证明了植物根际促生菌对其耐镉性和镉吸收积累的影响。项目立题依据充分、目标明确。

有工作基础、实验条件良好，具备完成本实验研究内容那个所必备的理论知识和技术。本人所在的实验室拥有先进的科研设施、实验平台，并建立了植物生理学、微生物学等相应的先进实验技术体系。

特色或创新之处

项目立题有新意，采用Alamo品种柳枝稷为材料，选取三种植物根际促生菌（Ma02、Ls01、Pi01），阐明外源添加植物根际促生菌对柳枝稷耐镉性及镉吸收积累的影响，研究思路清晰，可操作性强。以往有关柳枝稷的研究对于植物促生菌调控其耐镉性的探究甚少，对于筛选影响能源植物耐镉性和镉吸收积累的研究可为后续深入研究调控机制提供重要的基础。本实验重点分析外源添加根际促生菌这一耐镉性调控新思路对于柳枝稷这一模式能源植物的影响，期望阐明两者的关系，为明确其调控机制提供一定的研究基础，这将对丰富柳枝稷耐镉性调控研究具有重要意义。

研究计划及预期进展

1 研究计划

2018.8-2018.9课题相关的文献查阅及资料梳理，实验主要方法及关键技术的构建。并进行预实验。

2018.9-2018.11按照实验方案进行第一批次实验，测定各指标数据。

2018.11-2019.1分析第一批实验存在的问题，改进实验方案，进行第二批次实验。

2019.2-2019.3整理并分析实验数据。

2019.4-2019.5撰写论文，准备论文答辩。

2 预期进展

阐明植物根际促生菌具有调控柳枝稷吸收积累镉的能力，明确其机制。筛选出具有明显促进柳枝稷吸收积累镉的植物根际促生菌菌株。