1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
乳酸菌是革兰氏阳性菌，能够利用糖类发酵产生乳酸，为兼性需氧或严格厌氧型细菌[1]。乳酸菌主要包括乳酸杆菌属、链球菌属、魏斯氏菌属、肠球菌属、乳球菌属、双歧杆菌属和明串珠球菌属[2]。乳酸菌的代谢类型有糖酵解途径和磷酸戊糖途径，通过糖酵解途径发酵产生乳酸，为同型乳酸发酵，而由磷酸戊糖途径发酵进行异型乳酸发酵，产物除乳酸外，还有乙醇、乙酸和 CO2 等[1-3]。植物乳杆菌、嗜热链球菌等进行同型乳酸发酵，而双歧杆菌、肠膜明串珠菌等为异型乳酸菌[1-3]。
乳酸菌在代谢过程中能够产生多种有机酸和益生活性物质，不仅能够改善食品和饲料的风味和营养价值，而且能够促进人体和动物体对营养物质的吸收[1]。同时，有机酸形成的酸性环境以及乳酸菌产生的具有抑菌或杀菌效果的细菌素能够抑制有害微生物的生长，防止食物腐坏，延长食品保鲜期[6-8]。除了食品和饲料等传统领域，乳酸菌在医药领域也有巨大的应用前景[4-5,12]。研究显示，乳酸均具有黏附在消化道粘膜，形成屏障排斥病原菌的定殖的特性，能够抑制消化道致病菌和抗感染，同时，乳酸菌的生理代谢能够刺激消化道免疫反应，提高宿主的免疫能力，而其代谢物能防治感染性和功能性消化道疾病，增加肠蠕动，达到润肠通便的作用[4-5]；乳酸菌还能够降解胆盐和降解对动物机体有害的亚硝酸盐，从而促进胆固醇的分解代谢，降低胆固醇，维持肠道微生态平衡，增强机体免疫功能[5]。此外，乳酸菌还具有免疫治疗功能等益生特性，研发乳酸菌相关的药物也是研究热点[4]。
目前，国内对乳酸菌的研究大多集中于乳酸菌的分离筛选和生理生化特性分析应用，主要针对乳酸菌的产酸能力、对动物的可能的益生作用以及发酵产物对产品的影响方面。此外，一些乳酸菌的全基因组也已被测序，对乳酸菌DNA序列以及功能基因的研究也越来越深入[9,13,14]。这些研究对于乳酸菌生理生化特性研究以及功能基因研究，对乳酸菌资源进行充分利用，起到了非常重要的作用。
由于乳酸菌是人体和动物体内消化道的优势菌群，对人体和动物体无害，因此在食品、医疗和饲料领域有着重要的研究前景[10,11]。因此，分离筛选发酵性能优良的乳酸菌对改良发酵产品，开发相关功能性药物具有重要意义。本课题旨在从泡菜和酸菜中获得具有益生功能的优质乳酸菌，为乳酸菌发酵工业、饲料及医药研发等应用提供优质的菌种以及提供良好的研究材料。
参考文献：
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2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
从多种泡菜水中分离筛选具有益生功能的乳酸菌。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
1.1乳酸菌的分离纯化
将泡菜水原液和稀释液分别涂布于MRS培养基，将出现水解圈的菌落进行划线培养纯化。
1.2益生乳酸菌的鉴定
对获得菌株进行抑菌实验，抗氧化实验，酸耐受性实验，疏水性实验，黏附能力测定实验等，观察实验结果，筛选具有益生功能的乳酸菌。
1.3乳酸菌的16S rRNA的基因序列分析及种属关系的确定
将获得的菌株PCR进行16S rRNA 扩增，连接T载体（pMD19T）后用Amp抗生素培养基进行蓝白斑筛选，将获得的菌株进行测序。
1.4乳酸菌的生理生化鉴定
对获得菌株进行过氧化氢酶试验、革兰氏染色、葡萄糖产酸产气实验等，观察试验结果。
1.5抑菌乳酸均抑菌物质的初步研究
对获得的菌株产生的抑菌物质进行酶敏感性、三氯乙酸敏感性以及有机酸检测和抑菌谱研究。
2.技术路线
3.实验方案
3.1试验材料
培养基：MRS-碳酸钙培养基：葡萄糖 20 g / L，蛋白胨 10 g / L，牛肉膏 10 g /L，酵母膏 5 g /L，柠檬酸三铵 2 g /L，三水合醋酸钠 5 g /L，磷酸氢二钾 0.2，七水合硫酸镁 0.02 ，四水合硫酸锰0.005 ，吐温 80 1m L / L，碳酸钙 2 ，琼脂粉 1.5 ，山梨酸 0.14 ，p H 5.7-6.2
MRS液体培养基：去掉MRS-碳酸钙培养基中的山梨酸、碳酸钙
3.2试验方法
3.2.1乳酸菌分离纯化
将泡菜水原液进行稀释选取原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5作为稀释梯度，各取100μl涂布于MRS-碳酸钙培养基，每个梯度设置3个平行，28℃培养箱中3天左右。将出现透明圈的菌落进行划线纯化3代，选用MRS液体培养基接单菌落，石蜡油封存进行保菌。
3.2.2乳酸菌16s RNA鉴定和生理生化鉴定
对获得的菌株进行菌落PCR，PCR体系如下：
| 试剂 | 用量（μl） |
| ddH2O pfu buffer dNTP 引物1 引物2 DMSO Taq plus(Taqpfu 55 ) | 29 5 4 4 4 2.5 1 |
在纯化的第3代板中挑取菌落作为DNA模板进行PCR
| 温度（℃） | 时间 |
| 94 94 61 72 94 58 | 5 min 45 s 30 s 1 min 30 s 45 s |
将PCR产物连接制T4载体
| 试剂 | 用量（μl） |
| T4载体 T4 buffer T4酶 片段 ddH2O | 0.2 1 0.5 4 4.3 |
16℃过夜培养。将连接了片段的载体转化入DHSα
| 试剂 | 用量（μl） |
| 5X KCM ddH2O DHSα 连接片段的载体 | 10 30 50 10 |
冰浴20 min，在28℃培养10 min，加入500μl LB培养基，150 rpm摇床培养1小时，加入40μl20mg/ml的Xgal和70μl的2 IPTG，6000rpm离心5min，吸出上清400μl，将剩余沉淀和上清混匀，重悬菌体，涂布于AMP板 ，37℃倒置培养。用碱法抽提质粒，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶进行酶切；将酶切产物送测获得测序结果。
3.2.3乳酸菌生理生化鉴定
对获得菌株进行过氧化氢酶试验、革兰氏染色、葡萄糖产酸产气实验等鉴定。
3.2.4乳酸菌益生特性测定
将获得的菌株于液体培养基培养1天，制成菌悬液，将菌悬液梯度稀释，将指示菌涂布于固体培养基，再将菌悬液加入固体培养基，测定抑菌圈直径。
3.2.5对具有抑菌效果的乳酸菌产生的抑菌物质进行分析研究。
将获得的乳酸菌于液体培养基培养，获得发酵上清液，进行酶敏感性实验、三氯乙酸敏感性实验。并对发酵上清液进行高效液相色谱检测，确定其有机酸成分。
4.可行性分析
本科期间，我学习了《微生物学》、《分子生物学》等课程，获得了基础理论知识以及基本实验操作，而且所在实验室针对微生物的分离纯化以及生理生化鉴定和16s RNA鉴定积累了多年的经验，且具备微生物学和分子生物学研究的基本仪器设备，所以本方案具备一定的可行性。
4. 研究创新点
从多种泡菜中，分离出具有优良发酵性质的益生乳酸菌，以提高食品及饲料的营养价值，为乳酸菌发酵工业以及饲料生产提供优质的菌种来源以及提供良好的研究材料。
5. 研究计划与进展
1.研究计划
2019年3月：查阅相关文献，设计实验方案，准备试验所需试剂材料，并进行预实验，进一步完善实验方案。
2019年4月：根据实验方案，分离纯化乳酸菌，并对其进行生理生化鉴定及益生特性的研究。
