1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
棉花是我国重要的经济作物，并且广泛应用于我国纺织、食品、化工等各个行业，其抗病稳定性是影响种植效益的重要因素，由大丽轮枝菌（verticilliumdahliae）引起的棉花黄萎病（cotton verticillium wilt）是影响当前棉花产量的最重要因素之一，这是一种危害严重的土传性真菌维管束病害，侵染棉花后会引起叶片失绿变黄, 萎蔫脱落, 严重威胁棉花产量及纤维品质，造成严重的经济损失。
研究表明，当棉花黄萎病菌成功进入棉花根部细胞后, 菌丝会通过细胞间隙侵染邻近的细胞, 在矿物质和水分运输的过程中, 助推其在植物体内扩展, 另有部分菌丝穿过皮层向维管束方向生长, 并继续在植物体内蔓延。在棉花维管束内, 黄萎病菌的菌丝萌发产生大量具有活力的分生孢子, 通过纹孔侵染邻近的导管分子, 且随着蒸腾作用不断侵入到寄主的其他组织, 维管束呈现深褐色, 最终植株萎蔫, 组织坏死, 逐渐死亡。
而棉花植株细胞壁厚度与体内的生长素水平与棉花的抗黄萎病能力有很大关系。
2. 研究的基本内容和问题
本研究主要以陆地棉为材料，进行棉花黄萎病菌诱导的wat响应基因的筛选，并且进行wat家族相关基因的沉默（vigs）研究。
我们所研究的棉花黄萎病是一种土传性真菌维管束病害，病菌通过细胞间隙侵染邻近的细胞，在植物体内蔓延。其菌丝萌发产生大量具有活力的分生孢子, 通过纹孔侵染邻近的导管分子, 且随着蒸腾作用不断侵入到寄主的其他组织, 维管束呈现深褐色, 最终植株萎蔫, 组织坏死, 逐渐死亡。
wat在植物中普遍存在，并且在维管组织尤其是次生部分的形成中发挥着重要的作用，其发育表型与细胞壁形态有关，敲除这基因会造成细胞伸长减少、机械性能变化和干细胞次生壁厚严重减少。并且已经有多个研究表明，wat在抵抗多种植物维管束病害中中起到重要的作用并且在水杨酸和色氨酸的代谢中也起到重要作用。
3. 研究的方法与方案
本次研究使用病毒诱导基因沉默(virus inducedgene silencing ,vigs)体系对目的基因进行沉默。这是一种转录后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing ,ptgs)，根据植物反抗病毒入侵机制而开发的rna沉默技术，它利用病毒载体携带目的基因片段在寄主体内产生双链rna从而诱导目的基因沉默。
因为由烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus ,trv)诱导的基因沉默病毒的毒力轻微且寄宿植物范围广，因此我们选取trv病毒作为本次实验中目的基因的载体。trv的基因组包括两条正链rna分子，rna1和rna2。rna1编码rdrp、移动蛋白和一个富含半胱氨酸的蛋白，用于病毒基因组在宿主植物细胞中的复制及在细胞间的移动，rna2编码衣壳蛋白和两个非结构蛋白。我们将目的基因导入到rna2的部分，从而获得ptrv1和含有目的基因片段的ptrv2，载体构建完成后测序鉴定。
构好的载体需要转入到根瘤农杆菌中，通过根瘤农杆菌感染植物细胞。根瘤农杆菌通常生长在泥土中，能够从损伤的双子叶植物的根或茎侵入植物，并将其t-dna送入植物细胞，进入植物的t-dna可以整合到寄主基因组而产生稳定的转化植株，未整合的游离t-dna上的基因也可以利用植物表达体系进行瞬时表达。
4. 研究创新点
此前已经有过报道，拟南芥中的wat基因在维管束组织的次生结构中由重要作用，并且可以促进植物抵抗多种维管系统病害，但是这一基因家族在棉花中的作用并没有报道。
有报道表明，筛选出许多与棉花黄萎病响应的基因，但是并没有wat基因家族的相关报道，因此本研究主要探究wat在棉花抗黄萎病中的作用。
而截至目前，尚未找到有效的防治棉花黄萎病的方法。化学药剂和物理防治等常规的防治手段可以局部控制但不能有效防治, 采用传统的抗病育种策略培育抗病品种成效缓慢, 因此对其防治一直是棉花生产上的难题。长期的植物生产实践表明利用抗病分子育种手段来选育棉花黄萎病抗病品种是防治黄萎病的高效措施。
5. 研究计划与进展
2018年6月-2018年9月：确定课题，阅读相关文献资料，
2018年9月-2018年11月：目的基因的克隆与trv载体的构建，测序鉴定
2018年11月-2019年1月：基因沉默试验
