1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献） 1 本课题研究意义 近年来，全球变暖已引起各国对高温的重视，高温对植物造成损害，并诱导植物发生热应激反应。通过适当的高温驯化，植物的耐热性会增加。耐热植物中通过热休克蛋白、植物激素、抗氧化系统和膜脂等响应和适应热害，其中热休克蛋白是植物耐热性的重要因子。膜脂中不饱和脂质的增加会增强细胞膜的稳定性和植物的耐热性。 植物在生长发育过程中会受到各种非生物因子的胁迫，其中温度对植物生长发育的影响尤其严重。近年来，随着全球“温室效应”的加剧，气温上升，高温已成为制约植物生长的重要因素。一般认为，当温度高于环境温度10～15℃时。植物就会产生热激反应，在数小时内迅速获得耐热性，以抵御致死高温[1]。在高温胁迫下，所有生物都将产生热激反应(Heat Shock Response)。植物具有在高于适宜生长温度下存活的能力(基本耐热性)和获得抵抗热胁迫耐性的能力(获得性耐热性)，能在数小时内迅速产生获得耐热性，以抵御致死高温。超过适宜生长温度10～15℃(亚致死范围)，植物热激反应即被诱导。热激反应的作用是：①保护细胞和生物体免受严重损害；②恢复正常的细胞活性和生理活性；③通过热激蛋白(Heat Shock Proteins，Hsps)的高水平表达而提高耐热性。 高温对植物生理造成的影响包括：①光合作用受抑制、细胞膜损伤、细胞老化和死亡[2]；②细胞蛋白质广泛降解和凝集，导致所合成的蛋白质错折叠和现有蛋白质变性[3]；③基因表达全局转换，其中大多数基因的表达下降或者削弱，而热激基因迅速地高水平表达，使Hsps合成迅速增加[4]。但是高温会影响植物的各种生理生化过程，如抑制光合作用、改变细胞膜稳定性、改变激素和次级代谢物的合成。甚至导致植物死亡[l]，因此，探究植物耐热性机理和分子机制对于提高植物耐热性及植物的引种选育都具有指导意义。 2 国内外研究进展 植物热休克蛋白70（Heatshock protein 70，HSP70）参与应答生物和非生物胁迫、调控植物生长发育和细胞信号转导。拟南芥HSP70根据其表达情况可分为HSC70（heat shock cognate 70）和HSP70两大类。根据植物亚细胞定位情况，胁迫诱导性HSP70分为4个亚家族：通常C-端含EEDV基序的HSP70定位在细胞质，有5个成员组成；含HDEL基序的定位在内质网，又称BiP蛋白，是植物中研究最多的HSP70；含PEAEYEEAKK的定位在线粒体；含PECDVLDADFTDSK的定位在质体HSP70基因[5]。热激能诱导HSP70的大量表达并促使其聚集在膜组分中，阻止膜蛋白的热变性和生物膜的破碎。细胞受热后HSP70和膜外周蛋白结合并连接在质膜和液泡膜上，与膜蛋白发生分子互作而阻止膜蛋白的变性，稳定细胞膜和细胞骨架系统[6]。利用蛋白pull down技术，发现PLDδ蛋白与HSP70蛋白体外结合，暗示PLDδ与HSP存在互作关系，但其生物学意义尚不清楚。另外，烟草花粉管HSP70能够结合微管，且该过程受到驱动蛋白Kinesin的调控[6]。因此我们推断，植物细胞可能存在由PLDδ、微管骨架和HSP70共同调控的信号网络。该信号网络可能是：高温胁迫诱导质膜PLDδ活性升高，并促使其与微管结合蛋白的分离，维持细胞微管的动态稳定；同时，PLDδ通过调控胞内钙信号的变化，调节微管蛋白与HSP70的结合，影响微管的稳定。 3 应用前景 在众多参与植物热激反应的成分中，Hsps是最为重要的一类物质，利用转基因技术获得Hsps高表达的品种不失为一种有效的培育方法。此外，选育耐热品种，进行热锻炼及在幼苗上喷洒ABA、SA、Ca等植物生长调节剂也是提高耐热性的有效方法[7]。 尽管前人对植物的耐热性进行了较多的研究．但目前植物对抗热胁迫方面还存在一些问题：①对耐热性的遗传机理研究不够深入，多集中于对植物耐热性相关的农艺性状和生理特性的分析；②很多研究仅仅停留在实验中，许多实验结果并未能真正用到生产实践中；③对于植物的耐热性研究现阶段主要集中在农作物上等，对木本植物的耐热性研究比较少，而且对于木本植物的抗热性的研究还没有形成一个完整的系统。 高温胁迫是影响植物生长、降低农作物产量的主要非生物胁迫之一，因此．获得耐热性在内的各种抗逆性是人们最为希望得到的作物品质。我们只有通过在热胁迫环境下。对植物体内的一系列参数变化进行进一步的探究。才可以从变化中找到与抗热性密切相关的各种因素，为今后植物抗热性研究奠定重要的基础。 参考文献： [1]Wahid A, Gelani S, Ashraf M, et al. Heat tolerance in plants: an overview[J]. Environmental and Experimental Botany, 2007(61): 199-223. [2] XUS,LI J,ZHANG X,et al.Effects of heat acclimation pretreatment on changes ofmembrane lipid peroxidation,antioxidant metabolites,and ultrastructure ofchloroplasts in two cool-season turfgrass species under heatstress[J].Environmental and Experimental Botany,2006,56:274-285. [3] YOUNG T E,LING J,GEISLER-LEEC J,et al.Developmental and thermal regulation of the maize heat shockprotein,HSP101[J].Plant Physiology,2001,127:777-791 [4] MILLER G,MITTLER R.Couldheat shock transcription factors function as hydrogen peroxide sensors in plants[J].Annalsof Botany,2006,98:279-288. [5] Jungkunz I1.,Link K.,VogelF.,Voll LM.,Sonnewald S.,Sonnewald U. (2011).AtHsp70-15-deficient Arabidopsisplants are characterized by reduced growth, a constitutive cytosolic proteinresponse and enhanced resistance to TuMV. Plant J. 66(6):983-95. [6] Parrotta L.,Cresti M.,andCaiG.(2013).Heat-Shock Protein 70 Binds Microtubules and Interacts With Kinesinin Tobacco Pollen Tubes.Cytoskeleton. 70:522-537. [7] Amooaghaie R, Moghym S.Effect of polyamines on thermotolerance and membrane stability of soybeanseedling [J]. African Journal of Biotechnology, 2011, 10 (47) :9 673-9 679.
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2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 1.研究目标： （1）转基因方法获得PLDδ和HSP70的过表达和回补的拟南芥材料。 （2）高温胁迫下，拟南芥细胞周质微管动态变化和PLDδ蛋白对微观形态的调控作用。 （3）高温胁迫对PLDδ表达模式、亚细胞定位和活性的调控作用。 2.研究内容： 搞清在高温胁迫途径中PLDδ调控微管骨架的生理功能，解析基于脂信号的微管骨架、钙和热激蛋白HSP70的分子调控网络和对逆境适应的分子机制。 3.拟解决的关键问题： 通过HSP70与PLDδ相互作用并抑制PLDδ的活性，从而调控微管的形态变化；PLDδ、HSP70和微管三者共同调控植物的热胁迫。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1 研究方法 1.1 转基因方法获得PLDδ和HSP70的过表达和回补的拟南芥材料 构建PLDδ的回补载体ProPLDδ:: PLDδ-mCherry和ProPLDδ:: PLDδ，并将其转入到pldδ-1或pldδ-2，将获得的植株进行DNA和转录本水平的鉴定，并繁殖和筛选纯合体。ProPLDδ::PLDδ-mCherry转基因株系可用作PLDδ蛋白的亚细胞定位（包括高温处理PLDδ细胞内定位变化）。构建HSP70的过表达载体ProHSP70:: HSP70，并将其转入到WT，将获得的植株进行DNA和转录本水平的鉴定，并繁殖和筛选纯合体。 1.2 PLDδ重组蛋白纯化和体外微管特征分析 构建GST-PLDδ融合蛋白表达载体，并导入细菌BL21菌株，表达和纯化GST-PLDδ重组蛋白，利用PLDδ专一性抗体进行蛋白杂交分析纯化蛋白的纯度。利用浊度法和微管共沉淀技术确定PLDδ是否结合微管，并分析二者的结合常数；利用浊度法进一步确定PLDδ对微管聚合的调控（促进或抑制）。利用PLDδ专一性抗体和α-tubulin抗体在细胞水平分别标记PLDδ和微管，确定二者的亚细胞定位，并确定二者的结合是否受高温胁迫的调控。 1.3 PLDδ蛋白活性与耐高温性的研究 1.3.1 高温处理条件下PLDδ蛋白活性变化分析 将WT材料在45℃高温处理不同时间，采集样品并收集蛋白，利用H3标记的底物PC（磷脂酰胆碱）进行PLDδ活性变化分析（Zhang et al., 2012）；同时利用ProPLDδ::PLDδ-mCherry转基因材料活体观察PLDδ在细胞内的移动；超高速离心分离质膜蛋白，结合专一性抗体免疫PLDδ，蛋白水平上明确高温胁迫对PLDδ细胞定位的调控作用。 1.3.2 高温处理条件下PLDδ蛋白对微管稳定性的调控作用 将GFP-TUA6背景的各转基因材料在45℃处理条件下（5-60 min），观察植物子叶和下胚轴周质微管形态并统计微管数目，确定PLDδ蛋白对微管热稳定的调控作用。同时，利用较长时间高温处理（1-2 h）将各材料的微管彻底解聚，然后转移到正常的生长条件培养，实时观察其微管恢复状态的差异，进一步查明微管稳定性与高温胁迫的关系。 1.4胞质型HSP70表达分析 将WT、pldδ1-1或者pldδ1-2于45℃处理不同时间后，提取mRNA并进行体外反转录，设计胞质型HSP70的专一性引物进行实时定量PCR，验证其转录本是否受高温诱导及其PLDδ蛋白对其的调控作用；同时利用胞质型HSP70的抗体检测上述处理蛋白的表达量。 2 技术路线及实验方案
图1 技术路线图 3 可行性分析 有工作基础、实验条件良好，具备完成本实验研究内容那个所必备的理论知识和技术。本人所在的实验室拥有先进的科研设施、实验平台，并建立了植物学、分子生物学等相应的先进实验技术体系。 |
4. 研究创新点
| 特色或创新之处 1. 构建ProHSP70::HSP70-mCherry（与PLDδ结合的一个或者几个胞质型HSP70）载体，将其转入GFP-TUA6背景的WT、pldδ-1或者pldδ-2中。利用荧光叠加技术，确定HSP70是否与微管共定位。 2. 我们将克隆拟南芥胞质型HSP70家族中5个胞质HSP成员并构建HSP70-HIS载体。利用蛋白共沉淀技术，体外验证PLDδ是否与HSP70（一个或几个成员）结合
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5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 2018.10-2019.1：学习实验技能，查阅相关资料；鉴定hsp70突变体，构建载体35S::HSP70，35S::HSP70-GFP，ProHSP70::HSP70，并获得转基因植株。 2019.1-2019.4：体内外明确PLDδ蛋白与HSP70蛋白的互作，并利用 ProHSP70::HSP70-mCherry材料确定该HSP70体内是否结合微管，以及利用pldδ1-1 和pldδ1-2突变体初步分析PLDδ蛋白对二者结合的影响。 2019.4-2019.6: 体内外明确与PLDδ蛋白结合的HSP70成员，并利用ProHSP70:: HSP70-mCherry材料确定该HSP70体内是否结合微管，以及利用pldδ1-1和pldδ1-2突变体初步分析PLDδ蛋白对二者结合的影响。组织、撰写论文。
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