1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题研究意义及应用前景 花粉外壁外层的主要成分孢粉素是一种十分复杂的复合物，具有很强的化学惰性，具备抗高温高压，抗酸碱和抗酶解等特性，因此他被认为是保护花粉不受外界环境和生物胁迫的最重要的屏障，同时孢粉素在授粉和萌发过程中有着特异的作用。孢粉素具有极强的化学稳定性，并且能够抵抗酶和强化学试剂的降解，因此其化学组成并不完全清楚。相关分析揭示了孢粉素是生物聚合物的混合物，通过广泛的酯键和醚键偶联，主要含有长链脂肪酸、苯丙素、酚类和类胡萝卜素。孢粉素的主要成分是一系列的高分子化合物，这些高分子化合物难溶于亲水物质和有机溶剂，这给分离和分析其化学性质带来很大困难。 tkpr1、pks2和acos是水稻孢粉素合成关键酶相关基因，目前对这三个基因的研究甚少，本课题将研究其在孢粉素合成中所催化的反应以及对于相应底物的酶活性。2.国内外研究概况 目前研究认其由多羟基化长链脂肪酸和芳香族化合物通过酯键和醚键聚合形成。孢粉素成分的合成从起始到最终聚合的过程需要多个共同酶的参与。作为花粉外壁的主要成分，孢粉素脂肪酸的从头合成发生在绒毡层的质体中。乙酰辅酶a被脂肪酶合成酶催化后经过缩合、还原、脱水、还原等过程最终形成软脂酸。其后可以形成硬脂酸或者在内质网上被催化。 研究普遍认为，酯酰acp由酯酰辅酶a合成酶acyl-coasynthetase5(acos5)的底物，开始孢粉素成分的一条合成途径，酯酰辅酶a随后被查尔酮合成酶家族成员pksa与pksb催化加工生成多聚吡喃酮，之后细胞色素羟化酶家族成员cyp703a2与cyp704b1 参与多聚吡喃酮的加工，其产物经由多聚吡喃酮还原酶家族成员催化最终生成孢粉素单体物质。另外一条合成途径是由乙酰辅酶a直接催化形成丙二酰辅酶a，然后通过pksa与pksb加工形成类黄酮，类黄酮最后转换为孢粉素。 在孢粉素前体的生物合成过程中，近期又发现了以下几个相关的基因：apyrase（atp-diphosphohydrolase）、atac bps（cytosolic acyl-coa-binding proteins）、uam（udp-ara-binopyranose mutases）。apy6 和 apy7 的双突变体具有更薄的外壁，其含有少量的杆状和顶盖结构、随机沉积的含油层以及粘性花粉粒，可能是受到了多糖的干扰。三突（acbp4 acbp5 acbp6）所表现出的性状是花粉表面较为平滑、杆状结构和含油层的形状不规则，并且 osuam3 的 rnai 植物具有异常外壁，伴随着阿拉伯聚糖水平的降低。这些基因表达产物的生化功能依旧不明确。 拟南芥孢粉素相关已经研较为透彻。在拟南芥中，孢粉素通过大约八个基因调控的通路来合成。拟南芥中与孢粉素相关的基因male sterility(ms2)在绒毡层中表达，编码一种脂肪酸还原酶，可以催化六碳脂肪醜基载体蛋白（fatty acyl-acp）产生一种脂肪醇。在水稻中，有相关研究显示，水稻中defective pollen wall（dpw）基因编码的脂肪酰基载体蛋白还原酶和ms2功能相似，dpw和ms2都是在绒毡层中表达，所以说dpw和ms2可能是同源基因，在脂肪醇合成中有很重要的作用。 male sterility188 (ms188) 和它上游直接调控因子aborted mi-crospores (ams)是绒毡层发育的两个重要的转录因子。所有孢粉素合成蛋白都特异地在绒毡层中表达，并且被分泌进入另外的小室。 ms188,在绒毡层中表达的myb转录家族的转录因子，直接调控polyketide synthase a (pksa), pksb, male ster-ile2 (ms2), and a cytochrome p450 gene (cyp703a2)这些基因。与之相对的是，cyp704b1, acyl-coa synthetase5 (acos5), tetraketide a-pyrone reductase1 (tkpr1) 和tkpr2的表达在ams突变体中大量较少，但是在ms188突变体中却没有影响。但是是ms188而不是ams可以激活cyp704b1 acos5和tkpr1的表达,。在ms188突变体中，ms188同源物的主要抑制减少了这些基因的表达，这表示ms188以及其他myb家族的成员起到了减少这些基因表达的作用。当ms188被减少了，在ams突变体中，一些孢粉素合成基因的表达也减少了。因此，ms188是激活孢粉素合成的主要调控因子，而且，ams和ms188可能形成一个前馈环孢粉素生物合成途径的激活了快速花粉壁的形成。 孢粉素前体物质在绒毡层中合成，最终在花粉外壁上堆积。但是至今为止，孢粉素的运输机制依然不是很清楚，还有待更深入的研究。有研究表明，合成的脂肪族或者芳香族化合物被内质网相关酶cyp450，pks，tkpr催化然后运输到高尔基体中。脂肪酸，乙醇，聚酮和一些其他的衍生单体可以被abc转运体从绒毡层转移，这些转运体包括abc27/abcg26和abcg15，或者通过液体转运蛋白，比如osc6，这些物质转运到达花粉壁区域合成孢粉素前体物质。研究表明参与孢粉素合成的八个功能蛋白在花药发育第八期就出现在药室腔中[11]，这一现象说明在绒毡层细胞尚未失去形态与功能之前，孢粉素合成酶将从绒毡层细胞分泌进入花药药室腔中，而非随着绒毡层细胞的降解自然释放进入药室腔。孢粉素前体物质的合成在绒毡层细胞中完成，并最终转运至小孢子的表面积累构建成Ｔ字osc6形结构。有研究中发现的孢粉素合成功能蛋白在药室腔中高量与早期的累积，证明孢粉素前体物质的合成并不仅仅在绒毡层细胞中进行，其合成过程可能持续至孢粉素合成酶进入花药药室腔[12]。根据孢粉素合成酶在绒毡层与药室腔的双重定位可以推测，孢粉素前体物质的合成在绒毡层细胞中即开始进行，并随着花药发育首先转运入药室腔沉积在小孢子表面进行外壁外层结构构建的最初基础；随后在小孢子的快速发育过程中，药室腔中的高量功能酶能够继续工作催化生成更大量的孢粉素前体物质参与花粉外壁Ｔ字形结构的建成。小孢子的快速发育伴随着体积膨胀，其表面积的急剧增加以及Ｔ字形结构累积过程中物质原料的高量需求，使孢粉素前体物质仅仅由绒毡层细胞合成与转运到小孢子表面这一过程显得迟缓与低效。
参考文献
2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 1.研究目标及内容 （1）通过基因克隆完成TKPR1、PKS2、ACOS和两种TKPR1突变体片段扩增，并完成 GST载体构建。 （2）完成TKPR1、PKS2、ACOS和两种TKPR1突变体在大肠杆菌中的原核表达，并对获得的重组蛋白纯化。 （3）完成酶活测定，明确TKPR1、PKS2、ACOS在孢粉素生物合成途径中的作用。 3.2 拟解决的关键问题 本研究综合运用生物化学、分子与细胞生物学等技术手段，对TKPR1、PKS2、ACOS进行克隆、原核表达和酶活测定，以期了解其在水稻孢粉素生物合成途径中的作用。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1.技术路线
2.实验步骤 2.1片段克隆和扩增 利用实验室中已有的水稻 cDNA 和所设计的引物 PCR扩增TKPR1、PKS2、ACOS和两种tkpr1突变体。通过琼脂糖凝胶电泳以及试剂盒胶回收纯化扩增得到的片段，测定纯化后的浓度。 2.2表达载体的构建 （1）载体线性化:通过双酶切获得线性化载体。 （2）重组反应:将线性化载体和插入片段按比例混合，在Exnase I催化下，37度反应30 min即可完成重组反应，实现两线性化DNA的体外环化。 （3）转化感受态细胞:重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。 具体步骤： 1.在冰上解冻克隆感受态细胞 2.取重组产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀),冰上静置30 min 3.42°C水浴热激45 s后，立即置于冰上冷却2-3 min. 4.加入900 ul LB培养基(不添加抗生素)，37 C摇菌1 h(转速200 - 250 rpm)。 5．5000 rpm离心5 min,弃掉900 μ上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。 6.37度培养箱中倒置培养12-16 h 2.3测序 将阳性单菌落的菌液取 100-200μL 送测序公司测序以验证重组载体是否构建成功，若构建成功，则提取阳性单菌落的质粒，备用。
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4. 研究创新点
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特色或者创新之处 TKPR1、PKS2、ACOS 是水稻中与孢粉素合成相关的重要基因。孢粉素生物合成的古生化途径已被广泛地提出，但目前只在拟南芥中证明了该合成途径，其他植物物种中并未得到大量证实。水稻作为单子叶模式植物，又是世界主要农作物之一，孢粉素的合成对水稻育性的研究至关重要。通过本研究可以明确在水稻中三种基因合成酶催化的具体反应，从而进一步明确水稻中孢粉素的生物合成途径。 |
5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展研究计划及预期进展
2018年 11月-2019年 1 月：TKPR1、PKS2、ACOS基因克隆 2019年 2-3月：蛋白表达以及纯化 2019年 4 月：酶活测定 2019年 4 月-2019年 5 月：整理实验结果并撰写论文
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