1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.1课题意义
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌的典型模式生物，并且可以在多种情况下作为发酵生产的工程菌，目前枯草芽孢杆菌的外源dna引入方式主要有原生质体转化法，电击法，氯化钙法，但是枯草芽孢杆菌在自然状态下在对数生长期群体中就有5%-15%可以形成自发的感受态，在之前的研究中，由于这种自发形成的感受态转化效率较低，因此没有列入枯草芽孢杆菌转化的常规方法。本实验意在寻求通过基因工程手段诱导提高枯草芽孢杆菌中形成自发感受态的比例，从而提高该情况下枯草芽孢杆菌的外源dna转化效率，以开发一种全新的，成本较低的，不需要额外器材和试剂的枯草芽孢杆菌转化方法。
1.2国内外研究概况
2. 研究的基本内容和问题
使用基因工程手段，对枯草芽孢杆菌进行遗传改造，使其在特定诱导物的诱导下可以超表达ComK蛋白，或者使用切割位点失活的CRISPR-dCas9对ComK调控网络中对ComK进行负调控的转录因子进行抑制，以达到提高ComK的表达量的目的，从而诱导群体中感受态细胞占比提高，进而提高外源DNA的转化效率。
3. 研究的方法与方案
3.1研究方法：分别克隆诱导型启动子系统和comk，通过同源重组把两者拼接到一起，整合到枯草芽孢杆菌的染色质，构建出comk可以被外源诱导物诱导表达的枯草芽孢杆菌菌株。使用外源诱导物对该菌株进行不同时长的诱导，之后使用pub110对其进行转化，涂布，记录其转化效率，对数据进行分析，寻求最佳诱导时间。
3.2技术路线
4. 研究创新点
（1） 之前的研究中只考虑了利用ComK超表达来提高处于感受态的细菌的比例，没有关于通过抑制MecA，Rok，Rap蛋白等对ComK起负调控作用的蛋白达到这一目的的文献发表，而抑制这些蛋白的表达相对于超表达ComK对细菌的负担更小，而且可能会阻断感受态逃逸的基因环路，并且因此可能在诱导期间使一部分形成感受态的菌无法完成感受态逃逸，从而在诱导结束开始转化外源DNA前积累更多的感受态菌体。相对于原有的超表达思路具有这些理论上的优势，可能会使形成感受态菌体的比例比之前的超表达法更高，从而达到更高的转化效率。
（2） 我们在诱导启动子系统上采用了SebastianM. Castillo-Hair等人在2019年发布的T7lac系统，该系统相比与以前的诱导型启动子具有更低的泄漏和更高的激活动态[23]。
5. 研究计划与进展
预期获得可以使用外源诱导物诱导后可以产生较高比例感受态的枯草芽孢杆菌菌株，并且该菌株诱导后可以用于有效的外源DNA转化。
