1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
肠出血型大肠杆菌（eenterohemorrhagic escherichia coli, ehec）o157:h7自发现后在世界各地散发或地方流行，世界卫生组织已将o157:h7列为新的食源性病原菌。o157:h7 的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，ehec会在大肠中定居，并引起腹泻，出血性结肠炎，并导致溶血性尿毒症综合征（hemolytic uremic syndrome，hus）。由于缺乏有效的临床治疗方法，该细菌已成为全球性的公共卫生问题，因此对该菌进行有效的防控研究成为当前亟需解决的问题。因此本课题针对ehec进行研究，建立起其在小鼠肠道中的肠炎模型。
肠出血性大肠杆菌（ehec）是引起人畜共患的肠道人畜共患病原体，ehec的主要毒力因子可分为3大类，染色体上原噬菌体编码的志贺毒素基因（stx）、lee致病岛上决定a/e表型的基因和质粒编码的肠溶血素基因。确定ehec发病机理的重要毒性因子是志贺毒素基因（stx），stx由a亚基非共价结合到b亚基上形成。已有研究表明志贺毒素通过胞吞作用进入细胞，最后作用于核糖体的60s亚基，而stx的a亚基被切割成a1和a2片段，具有n-糖苷酶活性的a1到达较大的核糖体亚基，在该处切割28s rrna的特定腺嘌呤残基，从而停止蛋白质合成并导致细胞死亡。之后研究表明stx毒素与溶血性尿毒症综合征hus密切相关。
本课题针对大肠杆菌o157:h7展开研究，建立小鼠肠炎模型，利用基因重组技术对stx基因进行敲除，构建ehec志贺毒素基因缺失株，探究肠出血型大肠杆菌的致病机制。为后续研究利用无毒性ehec志贺毒素基因缺失菌株激发机体免疫应答及制备ehec o157:h7亚单位疫苗和单克隆抗体奠定基础。
2. 研究的基本内容和问题
随着分子生物学和遗传学的发展，近年来许多国家对EHEC O157: H7进行深入的研究。志贺毒素（Shiga Toxin，Stx）是EHEC的一种主要毒力因子，本次实验设计以EHECO157: H7 EDL933为实验对象，目标是对于肠出血型大肠杆菌的致病机制的研究。
本次课题选择大肠杆菌O157:H7EDL933菌株，首先建立小鼠肠炎模型，利用基因敲除技术，将研究菌株大肠杆菌O157:H7 EDL933中Stx基因进行敲除，构建EHEC志贺毒素基因缺失株。再将EHEC志贺毒素基因缺失株对小鼠进行灌胃处理，观察小鼠体重变化、粪便状况、活动情况等，每天取小鼠粪便以分析肠道内菌落定植情况，进行小鼠疾病活动指数（DAI）的评估。两周后处死，测量其结肠长度，进行HE染色观察结肠病变。通过建立EHEC志贺毒素基因缺失株诱导的小鼠肠炎模型，研究肠出血性大肠杆菌EDL933的致病机制，验证该肠道菌群在肠炎发生的重要作用。
已有研究表明，EHEC O157:H7 Stx阳性株感染会引起出血性腹泻和出血性结肠炎，首先，本次实验旨在揭示Stx基因是否是引起这些疾病的重要原因。其次，在实验开始前，根据GenBank中EHEC O157:H7菌株Stx基因序列,利用SnapGene设计合适的引物。最后，本次实验过程中的创新之处是如何敲除Stx基因。由于志贺毒素是由两个亚基组成的蛋白毒素，所有Stx毒素家族都包含有A-B亚基的基本结构，Stx毒素还包括两个亚型，一个是Stx1，另一个是Stx2，两段序列不相邻，因此本次实验将采用双交换方法敲除Stx的两段基因。3. 研究的方法与方案
研究方法：
选择edl933为实验菌株，通过查阅文献，选择合适的小鼠品系，进行预实验，实验处理组设置：空白对照组，一次灌胃与连续灌胃实验组。进行疾病活动指数（dai）评分（通过粪便、体重等指标定量小鼠肠炎严重程度），两周后解剖取小鼠结肠进行he 染色。分析小鼠的致病表型，选择合适的小鼠品系建立肠炎模型。
通过双交换敲除法，构建edl933志贺毒素缺失菌株Δstx edl933。进行动物实验，设置处理组：空白对照组，edl933野生型对照组，Δstx edl933实验组。进行疾病活动指数（dai）评分（通过粪便、体重等指标定量小鼠肠炎严重程度），两周后解剖取小鼠结肠进行he 染色，探究edl933的致病机制。
4. 研究创新点
近年来，随着分子生物学的不断深入，对出血性大肠杆菌ehec的研究水平已经进入分子水平，ehec毒力基因的结构、功能及其调节基因作用的研究取得了突破性进展。
ehec的特征性毒力因子是整合于染色体基因组中原噬菌体编码的志贺毒素stx，stx可分为两类stx1和stx2，本课题针对志贺毒素stx进行探索。
利用双交换敲除技术敲除stx1和stx2，探究stx基因缺失突变对机体免疫应答的影响，为后续研究利用无毒性ehec志贺毒素基因缺失菌株激发机体免疫应答及制备ehec o157:h7 亚单位疫苗和单克隆抗体奠定基础。
5. 研究计划与进展
1.建立小鼠肠炎模型
2. edl933志贺毒素缺失株的构建。2020年1月10日之前
3. edl933 致病机制的研究。2020年5月（待定）
