1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
研究概况及课题意义：麝香霉菌株产生的vocs具有很强的生物活性。实验室前期研究已经分离得到多株麝香霉菌株，并进一步通过实验证实这些麝香霉菌株产生的vocs对炭疽病菌、稻瘟病菌、大肠杆菌等十多种病原菌均有显著的杀死或抑制作用。在此基础上通过gc-ms鉴定出的vocs的成分，包括石竹烯、水芹烯、甘菊环烃、丁醇等。对凤阳麝香霉菌株zjlq024[1]的应用进行深入研究，结果表明其固体发酵产物产生的vocs同样具有强烈的抑菌活性，可以作为熏蒸剂，延长荔枝、芒果和香蕉的保鲜期，抑制苹果采后病害青霉病等[2-3]。前期麝香霉菌株资源的积累以及相关的应用研究，明确了麝香霉菌株的应用价值[4-6]。但是，现阶段关于麝香霉菌对病原菌的作用位点的研究报道很少，寻找潜在的基因位点将有利于进一步阐述麝香霉菌对病原菌的抑制机理。麝香霉菌生长速度缓慢、产生的vocs抑制自身生长、vocs易挥发等问题都为其广泛应用带来挑战。本研究将通过设计引物对疑似功能基因g7936、g815进行敲除，验证其功能，为以后的工作奠定了良好的基础。
应用前景：农业生产过程中农药的使用必不可少，我国的农药使用量也一直处在世界前列。化学农药虽然对病虫草害具有一定抑制作用、也可提高农作物产量，但其对环境造成的污染也应得到重视。残留在植株上、散落在土壤中的农药，可随雨水及农田排水流入相应水域，对水体和水生生物造成污染。而残留于植株和环境中的农药也可通过各种介质进入人体，进而威胁人类健康。因此，生物农药这种具有低毒、低残留特性的新型农药受到越来越多人的青睐。
生物农药被称为天然农药，通过利用生物活体（如真菌、细菌、昆虫、病毒等）或其代谢产物（如信息素、生长素、萘乙酸钠等）来抑制或杀灭农业有害生物。使用生物农药可以降低农业面源污染，保障农产品的质量安全。推进绿色农业发展，生物农药的推广应用必不可少[7-9]。
2. 研究的基本内容和问题
课题研究目的：凤阳麝香霉zjlq024产生的vocs具有很强的生物活性，能够抑制多种病原菌的生长，具有重要的应用前景，但产生的vocs对其自身生长也存在抑制作用，限制了基于凤阳麝香霉的新型菌剂的开发。实验室前期通过随机插入突变的方法获得两株生长速度明显快于野生型的突变菌株，且抑菌活性比野生型菌株更强，并通过hi tail-pcr明确了插入基因的位点为g7936和g815。因此本研究的目的就是选用凤阳麝香霉菌株zjlq024，通过设计引物对基因g7936、g815进行敲除，验证其功能。因为麝香霉菌对稻瘟病菌具有很强的抑制能力，故本研究以稻瘟病菌菌株guy11作为病原指示菌展开实验研究，通过转化子与病原指示菌guy11的对峙实验，来检测转化子的抑菌能力是否得到增强，同时对后期研究vocs抑制稻瘟病生长的机理提供菌株基础。
课题研究内容：
1.通过基因敲除技术获得麝香霉菌转化子
3. 研究的方法与方案
1.研究方法及手段
1.1引物设计
通过CE Design软件设计基因G7936、G815的上下游及HPH引物
| G7936 | UP | 2000bp | F | acgacggccagtgccaagcttACAACAAGGTTGAAAACTGTTGTGG |
| R | gtgagttcaggctttttcatAATAATGATTCTATGCGAAGCGG | |||
| HPH | 1000bp | F | ATGAAAAAGCCTGAACTCACCG | |
| R | ctCTATTTCTTTGCCCTCGGACG | |||
| DOWN | 1000bp | F | ccgagggcaaagaaatagAGTGTCCTAGATGTTTGGGTCGTAA | |
| R | gagctcggtacccggggatccACTCACAGCACAAAATCAGAGCG | |||
| G815 | UP | 1000bp | F | gagctcggtacccggggatccAACAACGGCAAGCCTGTCC |
| R | catCTAGTCATTCATCGGCGCATC | |||
| HPH | 1000bp | F | cgccgatgaatgactagATGAAAAAGCCTGAACTCACCG | |
| R | caggcttgccgttgttCTATTTCTTTGCCCTCGGACG | |||
| DOWN | 1000bp | F | atagAACAACGGCAAGCCTGTCC | |
| R | acgacggccagtgccaagcttCTAGTCATTCATCGGCGCATC |
1.2 片段胶回收
1) 取50ul片段产物于DNA mini columns中，加入200ul Binding buffer，10000rpm，离心1min；
2) 将收集柱中的液体倒回收集柱中，10000rpm，离心1min；
3) 弃甩出液加300ul Binding buffer，10000rpm，离心1min；
4) 弃甩出液加700ul SPW Wash Buffer，10000rpm，离心1min；
5) 重复步骤四；
6) 弃甩出液空柱离心12000rpm，3min；
7) 将收集柱放入1.5ml离心管中，吹风机冷风吹3-5min；
8) 在收集柱中加入50ul外用无菌水，置于37℃培养箱中温浴2min；
9) 12000rpm，离心2min，弃收集柱，将纯化片段于-20℃中保存待用。
1.3 多片段同源重组、转化
1.3.1 重组
1) 根据公式计算重组反应所需DNA量，于冰上制备反应体系；
2) 使用移液器轻轻吹打，短暂离心将反应液收集至管底；
3) 将离心管置于50℃水浴锅中30分钟；
4) 降至4℃或者立即置于冰上冷却。
1.3.2 转化
1) 将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻（DH5a）；
2) 取5-10ul重组产物加入100ul感受态细胞中，轻弹管壁混匀，于冰上静置30min；
3) 42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2-3min；
4) 加入900ulSOC或LB培养液（不添加抗生素），37℃摇床1h；
5) 将相应抗性的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热；
6) 5000rpm离心5min，弃掉离心管中900ul上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有相应抗性的平板上涂匀；
7) 37℃培养箱中倒置培养12-16h。
1.4农杆菌转化（大肠杆菌质粒导入到AGL1中）
1) 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于室温或手心片刻，待其部分融化处于冰水混合状态；
2) 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，轻轻混匀，于冰水浴中静置5min；
3) 将离心管置于液氮中速冻5min;
4) 迅速将离心管置于37℃水浴锅中静置5min，不要晃动水面快速转至冰水浴中静置5min；
5) 加入500ul无抗生素的LB液体培养基，28-30℃振荡培养2-3h，使菌体复苏，表达抗性；
6) 5000rpm，1min离心收菌，保留100ul左右上清，轻轻吹打重悬菌体；
7) 均匀涂布到含相应抗生素的LB固体平板上，28-30℃，倒置培养48-72h。
1.5农杆菌介导的ATMT转化法
1.5.1原生质体制备
1）将麝香霉菌ZJLQ024菌丝接入PDB中，摇床培养4-5天，菌液澄清不浑浊，菌体大小适宜；
2）用灭过菌的漏斗及茶包过滤锥形瓶中PDB，保留菌丝体，用无菌牙签把菌丝挑至2ml离心管中，加入约2ml溶菌酶缓冲液进行溶解，置于37℃水浴锅中，酶解4h；
3）将无菌棉花塞入10ml注射器中，将离心管混合液倒入注射器内，挤压过滤；
4）取滤液于4℃离心机中6000rpm,离心10min；
5）弃上清，取100ul STC缓冲液重悬沉淀。
1.5.2 ATMT转化
1)从经过转化实验获得的LB平板上挑取单个携带目的质粒的农杆菌单菌落，接种于5ml的LB液体培养基中（含有浓度为50ug/ml的Kan），放入28℃恒温摇床，200rpm进行过夜培养;
2)过夜后使用移液枪从中吸取200-400ul培养基，转移到5ml的AIM（含有spore、AS、kan）培养基中，放入26℃恒温摇床培养5-6h，使OD600达到0.5-0.6左右即可;
3)吸取100ul培养好的AGL1农杆菌菌液和100ul原生质体悬浮液均匀混合，将共计200 ul的混合液均匀涂布于表面覆有一层硝酸纤维素膜的AIM培养基平板上，在25℃下恒温共培养48h;
4)将带有共培养菌落的硝酸纤维素膜转移至含有相应抗生素的选择培养基平皿TB3上（含有400ug/mlCef，400ug/ml Hgyb，60ug/mlStr），将平皿放于26 ℃恒温培养箱培养到转化子出现即可挑取单菌落，挑取的单菌落放入TB3培养基单独培养后保存备用。
实验方案：
2.2.1 通过基因敲除技术获得麝香霉菌转化子
为了进一步研究其麝香霉菌ZJLQ024的生物学功能，本研究采用基因敲除技术，构建了含有潮霉素抗性基因(HPH)的基因，通过CE Design软件设计基因G7936、G815的上下游及HPH引物，对获得的片段进行纯化。利用多片段同源重组技术，与已线性化的pCAMBIA1300载体进行同源重组，导入到大肠杆菌感受态（DH5a）中。对同源重组成功的DH5a提取质粒，热激法导入至农杆菌感受态（AGL1）中，进一步采用农杆菌介导的ATMT转化法，由于凤阳麝香霉菌株ZJLQ024不产孢子，因此对其进行遗传转化需要以原生质体作为受体。让农杆菌侵染利用ZJLQ024制备的原生质体，于TB3加抗生素的培养基上培育转化子。
2.2.2转化子的性状分析
观察转化子的菌丝形态并测量菌落生长速度，与野生型的麝香霉菌进行对比，验证其生长速度是否加快，菌丝形态有没有发生变化。同时通过二格平皿与病原指示菌进行对峙培养法以检测转化子的抗菌活性，验证其抑菌能力是否得到增强。再对基因进行回补验证，确认是否是特定基因的敲除使麝香霉菌的功能得到优化。
2.2.3凤阳麝香霉转化子菌株应用研究
1）进行固体发酵条件的优化，确定发酵培养的最适培养基；
2）通过GC-MS对固体发酵产物的抑菌活性进行相关分析；
3）探究凤阳麝香霉转化子在生物防治中的初步应用。
4. 研究创新点
麝香霉产生的VOCs具有很强的生物活性，能够抑制多种病原菌的生长，因此麝香霉可作为一种重要的植物病害生物防治菌，具有重要的应用前景。
本研究在前期的基础上，构建G7936和G815的基因敲除突变体，阐明二者在VOCs抑制病原菌生长过程中的作用，有助于阐明VOCs抑制病原菌的机制，并为麝香霉的应用提供菌株基础。
5. 研究计划与进展
进度安排
2019年6月—2019年8月 查找相关文献，设计课题思路框架及应用方案；
2019年9月—2020年1月 目的基因敲除，获得工程菌株，初步设计菌株应用
