1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
dna甲基化是表观遗传修饰的主要形式之一，与基因表达的抑制密切相关，在形成基因组印迹、诱导果实成熟及响应环境刺激等生物学过程中发挥着巨大作用1，也是植物抵御转座子和病毒dna等入侵核酸的重要武器之一2。
在植物中，dna的从头甲基化通过rna介导的dna甲基化 (rddm)途径建立。经典rddm途径的关键因子包括pol iv和pol v这两种植物中特有的pol Ⅱ类rna聚合酶 (其最大的亚基分别被命名为nrpd1和nrpe1)，依赖于rna的rna聚合酶rdr2，rnase Ⅲ家族蛋白dcl3，argounaue家族蛋白ago4和甲基转移酶drm2。这一途径主要包括如下过程：pol iv转录出一段rna，随后在rdr2的催化下合成出双链rna (dsrna)3,4；dsrna随之被dcl3剪切成24 nt的sirna5，并被装载到ago4上6；ago4-sirna复合体接着与pol v转录出的支架rna互补配对，并招募drm2催化邻近序列的dna从头甲基化7,8。通过上述过程，rddm营造出惰性染色质环境，抑制基因表达，从而产生生物学效应。
如上所述，dna甲基化通过影响基因表达，可产生多样的性状和功能，对植物的发育和繁殖至关重要。启动子区的dna甲基化可通过抑制转录因子的结合或诱导形成h3k9me2等阻遏型组蛋白标记来下调基因表达9，只有当甲基化修饰被去除后，该启动子所控制的基因才能正常表达。比如，拟南芥的组织培养需要运用生长素诱导细胞重编程，去除转录因子wuschel编码基因wus启动子区的甲基化，才能使芽正常再生10,11。再如，拟南芥胚乳细胞存在仅有母系等位基因表达的印迹基因，其父系等位基因的启动子区被甲基化，且存在抑制性组蛋白标记h3k27me3，故表达受阻，而母系等位基因的dna未被甲基化，且带有激活性组蛋白标记h3k4me3，因而能够正常表达12。有趣的是，对番茄果实成熟的研究表明，一些情况下dna去甲基化也可抑制基因表达，其机理有可能是甲基的去除使转录阻遏物更易结合到基因上。此外，dna相同而表观修饰不同的等位基因可构成表观等位基因13，表观修饰的不同导致同一基因的差异表达活性，从而产生新的表型。将具有不同表观等位基因的植株杂交，可获得同时具有双亲优良性状的表观重组近交系 (epirils)14,15，产生杂种优势，在农业生产上有广阔的应用前景。当面临病毒dna等外界核酸的入侵时，原先因甲基化而被沉默的免疫相关基因可通过去甲基化启动表达，从而产生抗病性，与此同时，病原也会进化出新的效应因子增强抗病基因的甲基化以突破植物免疫防线，植物和病原间形成“军备竞赛”的关系16。综上，由rddm建立起的dna甲基化具有深远的生物学意义，是植物正常发育的重要保证，而dna甲基化在各过程中发挥作用的具体机理尚不清晰，还有待进一步研究。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标
鉴定出新的rddm途径调控因子，并研究其亚细胞定位情况。
2. 研究内容
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法
（1）植物材料和菌株
野生型(col-0生态型)和突变体拟南芥(arabidopsis thaliana)及本氏烟草(nicotiana benthamiana)栽培于25°c长日照(16 h光照/8 h黑暗)植物培养室。基因克隆使用大肠杆菌escherichia coli trans t1菌株，转化入重组质粒的细胞在加入相应抗生素的lb液体培养基中37°c过夜培养；用于烟草瞬时表达的gfp融合蛋白质粒转化入根癌土壤杆菌agrobacterium tumefaciens gv3101菌株，再转接至抗性lb液体培养基中，28°c过夜培养。
4. 研究创新点
（1）本课题采用反向遗传学方法，有望鉴定出此前未发现的RdDM途径调控因子，使此途径的具体过程进一步得到细化。在克隆出新调控因子的编码基因后，通过GFP融合表达获知其亚细胞定位情况，并通过结构域预测推断出其功能，有助于加深对RdDM途径调控因子及该途径本身的生物学功能的认识。
（2）从受病毒侵染烟草的RNA-seq数据中筛选出本课题涉及的拟南芥直系同源基因，获知在受到病毒侵染后这些基因的表达量是否发生了变化，以此从另一个角度揭示这些因子通过参与建立植物DNA甲基化来对抗病毒入侵的潜在生物学作用。
5. 研究计划与进展
1. 研究计划
本课题的研究目标是鉴定筛选出的待检因子是否为rddm途径中新的调控因子，若有阳性结果，则克隆编码该因子的基因，并通过在烟草叶片瞬时表达来观察其亚细胞定位，为今后研究植物dna甲基化在对抗生物胁迫(病毒侵染)方面的功能提供理论依据。
具体而言，先运用生物信息学方法筛选出合适数量的候选基因，订购相应t-dna插入突变体，通过基因分型筛选出突变体中的纯合子，进而通过chop-pcr检测相应基因缺失对植物dna甲基化水平的影响，阳性结果通过bs-seq进一步验证。克隆已验证的阳性rddm调控因子编码基因，在烟草叶片中瞬时表达，进而研究该基因编码产物的亚细胞定位情况。
