两个绿豆品种耐镉性差异研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

目前，我国耕地受重金属污染面积大，且呈现出加剧态势，对人们的身体健康、食品安全及生态环境均造成严重威胁^[1]。镉不是植物生长的必需微量元素，而是重金属污染源之一，对植物体、动植物及人类均具有毒害作用，但目前我国耕地的镉污染情况十分严重。镉(Cd)作为一种污染范围及生物毒性很大的重金属，不仅会对土壤造成危害，且镉随着工农业废水排出时，会给水体带来极大的污染，同时，由于镉能够被植物吸收而进入食物链，会产生累计作用，对如何有效合理修复镉污染问题亟待解决^[2,3]。镉(Cd)是植物生长的非必需元素，其作为毒性最大的重金属之一，破坏多种生化活性，而Cd对硫醇的高亲和力被认为是其毒性的主要机制。当Cd进入植物体内并积累到一定浓度时，会伤害植物矿物营养吸收系统，对钙、镁、铁等矿物元素的吸收等起到拮抗作用，结果使植物出现植株矮小，叶片枯黄，硕果产量低等现象，严重者还会造成植物的死亡；与此同时Cd与细胞核相互作用产生DNA损伤，影响DNA碱基修饰等，目前，已经在Cd胁迫下的拟南芥植株中检测了受损胚胎，但在绿豆中尚无发现该情况^[4,5,6]。

因此，清楚镉在植物体中的转运过程，为修复镉污染问题打下基础至关重要。绿豆常作为人类食物和动物饲料栽培，在我国种植广泛，研究计划通过生理学、转录组学和蛋白质组学的方法，以两种绿豆为研究材料，通过分析它们对镉耐受性的差异性，进一步研究绿豆响应镉胁迫的机理。

2. 研究的基本内容和问题

分析绿豆对镉耐受性差异性，发掘绿豆中与镉代谢相关相关基因，理解这些基因在镉代谢的作用，研究绿豆响应镉胁迫的分子机理，为选育低镉含量绿豆品种提供条件，也为绿豆的分子育种打下基础。

测定cd胁迫下不同绿豆材料生物量（根长、株高、干重）及植株不同部位cd含量，测定根系活力、叶绿素含量等相关生理指标，通过生理学方法分析不同绿豆材料cd的吸收和积累差异，比较不同绿豆材料耐镉性差异。

目前分子育种在提高作物的cd胁迫耐受性方面尚不成熟，但随着分子技术的迅猛发展，基于基因组学、转录组学或代谢组学开发的高通量芯片分型和基因组缔合研究（gwas）等技术，对耐受性相关分子机制阐明、基因/qtl定位以及目标基因育种应用具有巨大的推动作用^[7,8]。此外，基因工程技术将极大地促进优异cd耐受基因在多种作物间的利用，同时还可以改造出对cd吸附能力强的植物，用来缓解耕地中的重金属污染状况，从而降低作物籽粒或果实中积累的cd，保护食品安全和人类健康^[9]。

3. 研究的方法与方案

1、实验方案

（1）植物材料培养及生物量测定

绿豆种子经10％ H₂O₂消毒10-15min，去离子水清洗干净后，转移至蛭石中20-25℃萌发；3-4天后，挑选长势良好且一致的幼苗转移至500mL Hoagland营养液（梯度为1/8、1/4、1/2）的杯中培养，每个杯子移苗4棵。培养条件如下：昼夜温度25/20℃，相对湿度55-75%，昼夜循环为16h光照，8h黑暗，光照强度300-350 μmolm^-2s^-1。每两天换一次营养液，营养液Ph5.5±0.1。

移苗后，绿豆长至第三片叶展开，用CdCl₂处理，两个绿豆材料用Cd处理，每个处理3次重复，处理四天后收获。实验处理开始和结束时，用直尺测量根长和株高。Cd处理结束后，根用5mM CaCl₂洗涤15min，用去离子水清洗干净，吸水纸吸干表面水分后，分根、茎、叶收获，放入80℃烘箱干燥至恒重后测定根、茎、叶的重量。

（2）根系-染色法

取Cd处理后的绿豆根组织（距离根尖0.5-1cm），用5mM CaCl₂浸泡30min，去离子水清洗之后置于双硫腙染色液（30mg二苯基硫代巴比妥腙，60mL丙酮，20mL水，100mL冰醋酸）中浸泡1小时，去离子水清洗3-4遍。染色后的根置于体视显微镜下拍照，或经切徒手切片后置于显微镜下拍照。

（3）植株各部位（根、茎、叶）Cd含量测定

称取0.2g植物样品于洗净烘干的消煮管，加入3mL HNO₃：HClO₄(87：13，v/v)并对样品进行高温消解，消解完毕后用2.5% HNO₃定容至10mL，用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）分析植物样品中Cd含量并计算根、茎、叶的Cd浓度。

（4）Cd流速测定

利用非损伤微测技术检测根系Cd流速。培养成熟后进行Cd流速测定。在进行测定前，先分别在25和200μM Cd² 校准液进行电极校准，用50μM Cd² 测试液进行根系Cd² 流速测定。测定溶液含50μM CdCl₂、100μM KCl，20μM CaCl₂、20μM MgCl₂、500μM NaCl，100μM Na₂SO₄和300μM 2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES），pH5.7。SIET通过在距根尖200μm的距离进行振动测定，持续测定10-15分钟，每个处理测定20个生物学重复。

3、研究方法

根系-染色法：双硫腙在强碱环境中能与Cd生成红棕色的络合物，广泛用于分析植物中Cd的分布。铅离子（镉离子）绿色荧光探针是一种灵敏的Cd和Hg染料。在细胞加载染料后，非特异性酯酶裂解铅离子（镉离子）绿色荧光探针的乙酰氧基（AM）基团，导致其结构发生变化^[10]。裂解后的铅离子（镉离子）绿色荧光探针从细胞泄漏速度远比没有裂解的慢。在纳摩尔水平的铅和微摩尔水平的Cd的存在下，铅离子（镉离子）绿色荧光探针发出绿色荧光。这种方法常用于分析植物细胞中Cd的分布^[11,12]。利用双硫腙和铅离子（镉离子）绿色荧光探针对两种绿豆Cd的组织分布和细胞分布进行染色与分析。以期全面、深入地了解两种绿豆Cd分布特点，为后续研究提供相关基础和依据^[13]。

Cd流速测定：运用非损伤微测技术在正常生理状态下快速准确地测量离子流速的变化，直观地反映绿豆对离子的吸收情况^[14]。

4. 研究创新点

在前期的研究基础上，分析两个品种的绿豆的Cd分布特征，理解镉在绿豆不同品种中的耐受差异，拓宽对植物抗重金属研究的认识。

5. 研究计划与进展

1、2019.10-2019.11：理论学习阶段，阅读相关文献，设计实验思路。

2、2019.11-2020.4：进行实验，收集实验数据。