1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
磷脂酶（phospholipase）通过水解磷脂产生不同的代谢产物，可以调节膜脂组分、分子种和不饱和度，来实现细胞膜的不同功能。根据水解甘油磷脂的位置不同，磷脂酶分为pla1（phospholipase a1）、pla2、plc（phospholipase c）和pld（phospholipase d）。根据水解底物专一性的不同，plc分为pi-plc (phosphoinositides-specific plc)和 npc (nonspecific phospholipase c，或者phosphatidylcholine-plc)（nakamura et al., 2005；nakamura, 2014）。其中，人们对动植物中pi-plc的生化特征、蛋白功能和信号传导等研究较为清楚；pi-plc水解pip2（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate），产生ip3和dag, 二者调控下游信号转导和细胞应答（munnik, 2014）。植物 npcs 如何应答外界刺激并调控细胞应答，及其可能的分子机理，却知之较少。
拟南芥基因组编码npc蛋白有6个基因，分别命名为npc1-6。与 pi-plc 相比，npc 蛋白具有不同的生化特征。譬如，npc并不水解pip2，而偏好以pc、pe和lysopa 等脂类为底物（nakamura et al., 2005）；其活性不依赖于钙离子（peterset al., 2010； reddy et al.,2010）。这表明，npc可能参与调控与pi-plc截然不同的信号过程和生物功能。在组织表达水平，拟南芥npc3和npc4在根尖强烈表达，npc5在花器官表达量较高；npc2和npc6在荚果表达量高，npc1在各组织均有较高表（peters et al., 2010）。在亚细胞定位水平，npc3和npc4位于细胞质膜；npc5主要存在于靠近叶绿体的胞质，其可能参与磷脂在内质网和叶绿体的转运过程（nakamura et al., 2005；gaude et al.,2008）；其他三个npc3的亚细胞定位尚不清楚。已有研究表明，npc蛋白参与调控植物应答盐害和干旱、油菜素内酯信号和根发育等生物过程。其中，npc4参与植物应答盐和aba信号途径的调节。拟南芥npc4突变体在种子萌发、根发育和气孔运动等方面均表现为aba不敏感，而对水分、盐胁迫为敏感表型。
生长素参与植物生长、发育和逆境响应等重要过程（adamowski and friml, 2015； strader andzhao, 2016）。与其他植物激素相比，生长素具有相对特殊的生物合成、代谢平衡、极性运输和信号转导途径（feraru and friml, 2008）。生长素的跨细胞转运需要质膜定位的输出和输入载体蛋白，主要分为三种类型：生长素输入蛋白 aux1/laxs（auxin-resistant1/aux1-likes），生长素输出蛋白pins（pin-formeds ）和abcb/pgp蛋白（atp-binding-cassette b/p-glycoprotein）（grunewald and friml, 2010）。其中，大部分pins蛋白在质膜极性分布，该特征决定了生长素的极性运输方向、分布（feraru and friml, 2008）。拟南芥基因组有8个基因编码 pin 蛋白，分布于不同的根细胞。pin1蛋白主要在根中柱细胞表达；pin2蛋白在根表皮层和皮层细胞表达较高；pin4蛋白在根柱细胞表达较强；pin7主要在中柱和根柱细胞表达（feraru and friml,2008）。另一方面，pins蛋白极性分布、活性受其磷酸化水平所调控（michniewicz etal., 2007）。pp2a磷酸酶和agcviii激酶家族的d6pk（d6 protein kinase）和pid/wag（pinoid/wag）激酶均参与pins蛋白的可逆磷酸化（michniewicz et al., 2007; huang et al., 2010; galvan-ampudia et al.,2013; haga et al., 2014; zourelidou et al., 2014）。
2. 研究的基本内容和问题
围绕“明确npc应答高铵胁迫的分子机理” 这一目标，本项目从npc脂酶活性、pins转运活性和生长素极性分布等方面，从生理生化、细胞和分子遗传等方面深入揭示npc与pins互作模式及其分子机制；利用蛋白截断表达、蛋白点突变技术，探寻 npc结合pin4的关键位点，并揭示该位点对其转运生长素活性和植物耐盐的影响。
拟解决的关键问题：实验过程中，转基因等手段获得纯合体材料，需要多次筛选鉴定，这一过程周期比较长，比较繁琐；互作蛋白筛选时，筛选效率低，找不到预想蛋白，需要多次筛选，工作量大，周期长。
3. 研究的方法与方案
本实验以野生型拟南芥；npc3/4/5遗传材料；npc缺陷突变体拟南芥；npc3/4/5基因双突变和三突变体、启动子-gus和mcherry标记蛋白的转基因材料；突变体回补材料；野生型过表达拟南芥为材料。
1. npc3/4/5遗传材料的获得、盐处理表型分析。
4. 研究创新点
近年来随着科研的不断深入，人们对NPC的研究越来越多，对其功能了解也越来越清楚，发现NPC在调节植物的生长发育、应对生物和非生物胁迫及信号转导过程中有着重要的作用。通过研究发现，在铵盐胁迫下，植物可以通过对体内的生长素进行重新分配，从而使植物避开铵盐胁迫，而且也发现这与PIN2蛋白有关，但具体的信号传导过程还不够明确。
本项目通过分子、细胞和遗传等方面综合研究，在研究思路、研究技术、实验材料和人员设备配备上能确保深入阐述NPC调控生长信号转导和应答高铵胁迫的分子机理，揭示一条脂信号的PINs转运和生长素极性分布的植物耐盐调控网络。
5. 研究计划与进展
2020年2月-2020年3月：设计实验方案并准备好实验相关材料
2020年4月-2020年5月：利用基于crispr/cas9的多基因编辑技术构建npc3/4/5基因单突变、双突变和三突变载体，筛选出侵染纯合体进行盐处理，表型观察，并进行数据统计，探究其作用机理；运用bifc来验证npc3/4/5与pin4互作。
