1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
当细胞处于正常生理条件下，胞内的老化物质、有害物质和多余的营养物质可以被特殊的膜泡包裹起来，经过特定的生物学过程进行降解，生成小分子产物可用于回收并参与到其他细胞所需营养物的合成中[1]，以上即自噬的主要过程，这种特殊的膜泡即自噬泡。当细胞处于非正常生理条件下，如逆境中，自噬过程也会被启动，将非急需的物质通过自噬过程代谢后再利用其生成维持生命活动的关键物质。因此，对自噬过程的机制研究不仅有利于人们增强对细胞合成与代谢方式多样化的理解，更重要的是，通过研究自噬过程的相关基因和蛋白，理清自噬信号通路，有助于人们找到抑制自噬的靶点治疗神经退行性疾病，激发自噬治疗癌症，防止各种慢性病以及延缓衰老[2]。目前，细胞自噬的机制问题仍受到国内外学者的广泛关注。国内外相关研究虽已基本阐释了自噬泡的产生、延展以及封口的大致过程，但具体的分子机制仍不清楚。以自噬泡的封口过程为例，研究表明内体蛋白分选转运复合体(ESCRT)可以发挥类似于逆剪切的功能，从而介导自噬泡封口以成为成熟的自噬体。相关研究发现Vps21对自噬体的结构和功能具有重要调控作用[3]。最新研究揭示了在Vps21的调控下，ESCRT的亚基蛋白Snf7可与自噬体前体上的Atg17互作促进自噬泡封口，证明了Vps21至少通过控制以上两个蛋白调控封口过程[4]。事实上，Vps21极有可能也控制其他蛋白的互作从而共同调节自噬体的封口机制，这也是本课题的重点研究任务。
2. 研究的基本内容和问题
本课题重点研究在Vps21/Rab5的调控下相关蛋白的互作对自噬体封口的作用机制。前期研究表明，自噬行为起始于自噬泡的产生，随后自噬泡通过延展和形变形成囊状结构，包裹待降解的营养大分子，完成封口后与溶酶体等结合，进行内容物等降解。本课题在前期研究中发现，在vps21缺失突变体中，Snf7与Atg17共定位异常，产生无法闭合的自噬体前体，即封口过程受到影响。通过GBP Nanotrap技术[5]人为发生共定位后，发现Vps21/Rab5可通过调节Snf7-Atg17互作促进封口发生，但未能完全回补vps21缺失突变的表型。同时又发现在vps21缺失突变体中，Atg21和Vps34共定位异常，从而导致自噬泡封口过程受阻。因此我们预测Vps21/Rab5也通过控制Atg21和Vps34的互作调节自噬体前体封口。现本人利用GBP Nanotrap技术人为使Atg21和Vps34共定位，产生互作，观察其互作是否可以补偿vps21的缺失，从而进一步揭示vps21调控封口行为的机制，为解决人类相关疾病问题提供相应的理论基础和依据。
3. 研究的方法与方案
本课题的基本研究方法是利用gbp nanotrap技术，将vps21缺失条件下共定位紊乱的蛋白atg21和vps34人为共定位，通过观察atgs入液泡的状态判断自噬体封口功能是否完全，再利用基因重组技术回补vps21，观察自噬体封口功能的恢复情况，从而探究vps21调控下的自噬体封口机制。
技术路线和方案
4. 研究创新点
本课题切入点巧妙，构思新颖，有较好的创新性。在选题方面，自噬作为近年来的研究热点，其机制研究越发受到关注。本实验室在研究自噬体的封口机制时，开创性地发现内吞体分选转运复合体（escrt）的亚基蛋白受上游信号的调控，从而促进自噬体封口[9]。这一重大发现不仅揭示了上游信号和escrt行使功能的桥梁，而且引起了对其他亚基蛋白的关注和研究。既然vps21可以介导snf7和atg17的共定位，那么vps21是否也介导其它亚基蛋白的共定位共同促进自噬体封口呢？沿着这条思路，本课题在前期发现并选取了另外两个潜在的功能蛋白进行研究，具有较高的创新性和趣味性。
另外，在研究蛋白质-蛋白质相互作用的功能时，技术上的难题之一便是将蛋白质之间定位以及的相互作用和他们的功能偶联。传统的方法是通过构建嵌合体[10]，将编码蛋白质基因的开放阅读框用短肽进行偶联从而表达，然而简单地增加编码序列容易导致翻译后折叠形成的蛋白质异常，大分子之间的排斥力会影响到蛋白质构象，无法最大可能地接近其天然状态，进而影响了蛋白质的功能表达。这对研究就造成了巨大的误差，实验结果就显得不那么可靠。为了尽可能减少这一问题所带来的不便，我们采用了另一种方法，即利用gfp-gbp的结合，分别融合待验证相互作用的蛋白，从而间接地将两个蛋白拉在一起，最大可能地保留了其结构的完整性和天然状态，并且很好地适应各种模式生物[11]。
5. 研究计划与进展
本课题于2019年10月起开展，预计于2010年12月前完成分子克隆相关实验，测序验证正确性，并准备好相应所需的菌种，做好保藏工作。之后于2019年12月起开展整合工作，将构建好的质粒分批整合到酵母基因组。预计于2020年6月前完成荧光检测与免疫沉淀实验。
