1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）
一、意义
依赖于h2s的蛋白质硫巯基化是继磷酸化( phosphorylation)、泛素化( ubiquitylation)、乙酰化( acetylation)和s-亚硝基化( s-nitrosylation)等之后的一种新的蛋白质翻译后修饰方式。目前研究结果说明依赖于h2s的硫巯基化修饰在动物体内普遍存在，其通过影响蛋白质活性和功能，从而在细胞内信号通路中发挥重要的调控作用，故推测硫巯基化修饰还在植物细胞内信号通路和形态建成中也发挥重要作用。本研究检测番茄slgapc2蛋白是否能发生巯基化修饰，结果可以印证之前对于硫巯基化修饰植物蛋白的作用的猜测，也为其他植物蛋白的硫巯基化修饰检测提供了一定的实验参考。
2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题 一、研究目标 通过番茄SlGAPC2的原核表达，并且对其表达出的蛋白质进行检测，研究其是否能被外源硫巯基修饰。 二、研究内容 1、获取番茄SlGAPC2基因片段，并实现其原核表达 2、对表达蛋白进行硫巯基化修饰检测，通过检测结果研究番茄GAPC2蛋白是否能被外源硫巯基修饰 三、拟解决的关键问题 1、拟解决的关键问题：获得足量的SlGAPC2的原核表达蛋白 2、拟解决方案：本实验选择将转入菌株中的复制株和表达株分开：选择先将重组质粒转化至相对廉价的大肠杆菌中并进行检测，这样可以有效利用阳性复制株进行质粒复制来获取大量成功的重组质粒。在表达时选取了相对贵一些的大肠杆菌Rosetta作为表达株，在阳性复制株中重提质粒转化至Rosetta菌株中，这样就会减少Rosetta菌株的浪费，同时又能在一定程度上保证蛋白表达的成功率。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 一、研究方法 1.使用Trizol试剂盒从番茄根部组织提取总RNA 2.用双酶切鉴定法挑选出重组质粒中的阳性重组质粒 3.采用PCR法以番茄cDNA为模板扩增GAPC2基因片段 4.用改良生物素转化法检测表达蛋白是否存在硫巯基化修饰 二、技术路线
三、实验方案 1、材料培养 本实验所用的植物材料为番茄“白果强丰”，种子经2 %次氯酸钠（NaClO）表面消毒6 min后再用蒸馏水充分冲洗30 min，均匀将种子铺于用7 mL无菌水充分浸润的滤纸上，并置于25±1 ℃的恒温培养箱中避光培养3d。挑选发芽长势一致的番茄幼苗置于9 cm培养皿中培养4 d（Meietal.BmcPlantBiology,2017,17）。 2、提取番茄RNA并反转录获取cDNA 选取相同数量、长势一致的一周龄番茄幼苗，取根部组织，使用TRIzol试剂盒（Gibco-BRL），参照说明书提取总RNA。使用AMV反转录酶试剂盒（ReverseTranscriptaseXL，产品编号：D2620），参照说明书合成cDNA。 3、设计引物扩增目的基因 设计引物需要注意：引物长度一般在18-27 bp之间；GC含量在40% - 60%之间，Tm值最好接近72℃；引物3′端要避开密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率；引物自身及引物之间不应存在互补序列，引物自身存在互补序列会折叠成发夹结构，引物之间存在互补会形成引物二聚体，这都会使引物的有效浓度降低。 所以根据上述原则和 Genbank中已知的SlGAPC2基因序列设计多种引物扩增目的条带，根据PCR情况，选择扩增效率最高的，这样就获得了有效的GAPC2基因。 4、质粒重组并导入大肠杆菌 SlGAPC2基因的原核表达，经多渠道查阅参考文献后选取了pET-28a( )原核表达质粒[15]，将第一阶段获取的SlGAPC2基因插入此质粒并转化至大肠杆菌中进行一次鉴定。将一次鉴定为阳性的转化进行单菌落扩增，再提取质粒转入正式实验菌株大肠杆菌Rosetta中。 5、蛋白硫巯基化修饰检测 对转入阳性质粒的Rosetta菌株进行扩增培养并诱导蛋白表达，将表达出的蛋白质进行纯化后用改良生物素转化法对其进行硫巯基化修饰检测。 四、可行性分析 学校长期有实验室从事硫巯基化修饰相关研究，技术成熟且已经取得了大量的优秀研究成果。本文参考了预实验得出的实验条件，提出的实验方案均有相关文献支撑，这些研究基础是本次实验的成功实施的可靠理论保障。 实验试剂和仪器齐全，实验者已接受过相似的分子生物学实验的训练，操作熟练。实验室具有的实验技术和严密的实验计划也确保了本课题在实践上能顺利在期限内完成。
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4. 研究创新点
| 特色或创新之处 蛋白硫巯基化修饰作为一种新发现的蛋白质修饰方式，对于植物细胞中很多生理过程均有一定的调控作用。本课题紧密跟踪蛋白硫巯基化修饰这一热点研究领域，选取番茄GAPC2为目标蛋白，探究其能否被外源硫巯基修饰。这不仅为其他植物材料的硫巯基化修饰检测提供了实验基础，同时也为硫巯基化修饰作用研究提供了数据支持。
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5. 研究计划与进展
| 研究计划及预期进展 一、研究计划 2019.10.18—2019.11.16 查阅和收集资料，撰写文献综述 2019.11.16—2019.01.03完成论文选题，确定具体实验方案 2020.01.04—2020.01.17培育番茄，提取RNA并反转录得到番茄cDNA 2020.01.18—2020.04.01 完成开题报告 2020.04.21—2020.05.14完成番茄GAPC2蛋白的原核表达，并对表达蛋白用改良生物转化法进行蛋白硫巯基化修饰检测 2020.05.15—2020.06.06 毕业论文撰写及修改，提交论文终稿并答辩。 2020.05.21—2020.06.06 准备毕业论文答辩工作 二、预期进展 1.获得SlGAPC2基因的阳性重组质粒，得到足量的SlGAPC2原核表达的融合蛋白，对融合蛋白进行硫巯基化修饰检测，研究番茄GAPC2蛋白是否能被外源硫巯基修饰 2、撰写毕业论文1份。
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