1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1. 沙雷氏菌简介
沙雷氏菌(serratia sp.) 又称灵杆菌，是肠杆菌科中的一种兼性厌氧菌，能产生非水溶性黄、紫和红色素的革兰氏阴性细菌。沙雷氏菌属的菌株在自然界中的分布很广泛，存在于环境中的水、土壤，植物叶片以及动物人类的呼吸道和肠道中；它不仅是一种致病菌，其产生的灵菌红素有抗菌抗肿瘤等活性。
2. 组氨酸激酶
2. 研究的基本内容和问题
研究目标
将沙雷氏菌fs14中组胺酸激酶01990全长极其膜外部分表达纯化
3. 研究的方法与方案
研究方法
PCR用于扩增目的基因；
限制性内切酶及连接酶用于构建含目的基因的表达载体；
一步转化法用于目的基因导入宿主菌
电泳跑胶检查目的基因是否正确导入载体；
亲和层析法用于蛋白的分离纯化；；
技术路线
| PCR扩增目的基因 |
| 目的基因连接表达载体 |
| 重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 挑取正确转化子提取质粒并鉴定正确的重组质粒 |
| 转化正确的质粒至大肠杆菌C43中 |
| 诱导表达 |
| 分离纯化 |
实验方案
1. PCR扩增目的基因
以以沙雷氏菌FS14总DNA为模板进行PCR，扩增目的基因。
2. 目的基因连接表达载体
将含有目的基因的片段进行酶切，灭活后连接载体。
3.重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞
将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布培养。
4. 挑取正确转化子提取质粒并鉴定正确的重组质粒
选取长势较好的菌株接入液体培养基培养，通过碱裂解法提取质粒，并进行凝胶电泳检测。将总长度正确的质粒用单双酶切法检测后测序。
5. 正确的质粒转化至大肠杆菌C43
通过一步转化法将重组质粒转入大肠杆菌C43。
6. 诱导表达
通过SDS-PAGE检测诱导产物大小正确性。
7. 分离纯化
用亲和分离层析进行初步分离纯化，获得较纯的目的蛋白
可行性分析
（1）实验技术方法成熟：
项目指导教师在分子生物学、蛋白结构学等研究方面积累了丰富经验，实验技术方法成熟。本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中，可以在一年内完成课题，并完成结题报告。
（2）试验条件与设备齐全：
具备本项目实施所需的各种实验技术方法及实验设备，实验条件成熟。
（3）申请者学习及科研兴趣浓厚：
申请者有相应的专业基础与专业素养，对研究课题充满兴趣，拥有良好的实验技能以及一定的实验经验；并且申请者具有不怕苦不怕累的精神，勇于进取。
4. 研究创新点
双组分系统有多个“靶点”，如感应外界刺激的位点、激酶自主磷酸化位点和反应调控蛋白磷酸化位点等，探究双组分信号转导系统的机制，找到双组分蛋白反应的靶点，为更好地设计双组分系统的抑制物提供了条件，因此对双组分蛋白结构的研究十分必要。粘质沙雷氏菌也是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，亦是临床上常见的条件致病菌，在机体免疫功能降低时可引起肺部和尿道感染以及败血症，且PmrA/PmrB双组分系统是粘质沙雷氏菌相关研究中未曾出现过的，因此粘质沙雷氏菌 PmrA/PmrB双组分蛋白结构的研究对寻找该双组分反应靶点从而设计其抑制物有着重要意义。
5. 研究计划与进展
2019年10月-2019年12月，查阅资料、文献；学习和熟悉基本实验操作。
2020年2月-2020年3月，构建含基因01990全长的重组质粒，蛋白表达及纯化。
2020年3月-2020年4月，构建含基因01990胞外部分的重组质粒，蛋白表达及纯化。
