1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
微生物生活在多种多样的环境中，为了应对动态变化的外界环境，细菌需要具有即时感应外界环境信号变化并作出响应的能力，双组分调节系统(two-component system)就是细菌体内存在的最重要的信号转导系统。
双组分调节系统是1986年，ninfa 和magasnik在研究大肠杆菌氮代谢调节时发现的[5-6]，主要包括两个组分，分别是组氨酸激酶和反应调控蛋白。双组分系统是通过两个组分之间的识别和磷酸转移实现信号传递的，组氨酸激酶的感受器结构域能够检测到体内外刺激，从而调控传递器结构域的活性，催化依赖atp的组氨酸残基发生自我磷酸化，并随后将组氨酸残基上的磷酸基团转移到反应调控蛋白的天门冬氨酸残基上，使受体调节蛋白的构象发生变化，从而使其可以作为转录因子与下游被调控基因的启动子结合或与蛋白相互作用，调控基因的转录或其它应答反应[1-4]。
尽管双组分系统主要由这两个组分组成，但实际上细菌体内的双组分系统组成有时并不只有两个,还具有额外的辅助蛋白[7]。如磷酸转移蛋白，组氨酸激酶自磷酸化后会先将磷酸基团逐级传递给下游的磷酸转移蛋白，再转移至反应调控蛋白，譬如sln1家族中的反应调控蛋白便是接受磷酸传递蛋白ypd1的磷酸基团[19]；再如调控双组分系统信号终止反应的辅助磷酸酶chez [8]。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标
获得沙雷氏菌fs14中的组氨酸激酶ttrs (11880)全长和胞外感受器结构域的体外重组表达蛋白
3. 研究的方法与方案
1. 研究方法
采用分子生物学，蛋白质化学方法，如PCR，基因克隆，蛋白的体外表达及亲和层析等方法进行研究，如用PCR技术扩增目的基因DNA片段；用亲和层析的方法获得目的蛋白。
2.技术路线
| PCR扩增沙雷氏菌TtrS组氨酸激酶（11880）全长和胞外感受器结构域基因 |
| 将TtrS（11880）全长和胞外感受器结构域基因克隆至pET-24b载体 |
| 将含有TtrS（11880）全长和胞外感受器结构域基因片段的重组质粒分别转入大肠杆菌DH5α感受态细胞 |
| 提取质粒并鉴定获得正确的TtrS（11880）全长和胞外感受器结构域基因与pET-24b重组质粒 |
| 将鉴定正确的质粒分别转化至大肠杆菌C43中 |
| IPTG诱导表达及表达条件的优化 |
| 全长和胞外感受器结构域的TtrS蛋白的分离纯化 |
| 获得较纯且聚合状态单一的全长和胞外感受器结构域的TtrS蛋白 |
3. 实验方案
1. PCR获取TtrS（11880）全长和胞外感受器结构域基因
以沙雷氏菌FS14总DNA为模板进行PCR，扩增得到TtrS（11880）全长基因和胞外感受器结构域的基因片段，进行凝胶回收获得纯化的基因片段。
2. 构建TtrS（11880）全长基因和胞外感受器结构域的基因重组质粒
将胶回收后的TtrS（11880）全长基因和胞外感受器结构域的基因片段和pET-24b质粒均用NdeⅠ和xhoⅠ限制性内切酶进行酶切，使用T4 DNA连接酶连接所获基因片段和酶切质粒，构建重组质粒。
3. 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞
将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中(100μl体系)，超净台加入500μlLB液体培养基，振荡培养后离心，弃400μl上清，剩余液体吹打混匀，均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，倒置培养。
4. 提取质粒并鉴定正确的重组质粒
随机挑取单菌落，接种于LB培养液中，振荡培养过夜后提取质粒，并进行酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒对应的单菌落接种于3ml LB培养基（含卡那霉素）中，振荡培养后取适量送测序公司测序鉴定。
5. 正确的质粒转化至大肠杆菌C43
将测序鉴定正确的重组质粒转入表达宿主菌大肠杆菌C43感受态细胞中，摇床复苏后均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上倒置培养 。
6. 诱导表达
随即挑取单菌落接种于3ml LB培养基（含卡那霉素）中过夜培养，次日转接至两支新鲜3ml LB培养基（含卡那霉素）中振荡培养，一段时间后在其中一管添加合适浓度的IPTG诱导表达，另一管不加诱导剂作为阴性对照，继续培养后收集菌体，通过SDS-PAGE检测诱导产物TtrS全长和胞外感受器结构域的蛋白表达情况。
7. 表达优化
挑取单菌落接种于3ml LB培养基（含卡那霉素）中过夜培养，次日转接至两支新鲜3ml LB培养基（含卡那霉素）中振荡培养，过不同时间分别在其中一管添加不同浓度的IPTG诱导表达，另一管不加诱导剂作为阴性对照，继续培养后收集菌体，比较不同条件蛋白的表达情况，优化蛋白的表达条件。
8. 分离纯化
挑取能够表达的单菌落接种于3 mL LB液体培养基中活化后转接到100mL LB液体培养中作为种子液，次日转接1L LB 液体培养基中（含卡那霉素），根据表达条件优化结果，将培养液于最适条件培养，待菌液冷却后加入最优浓度的IPTG继续培养。待培养完成后，收集菌体，加入binding buffer（50 mM KH2PO4/K2HPO4 pH7.6, 300 mM NaCl, 10% Glycerol, 5 mM咪唑）重悬菌体，充分混匀后加入PMSF，用超声波细胞破碎仪对菌体超声破碎，将裂解液4 ℃, 12000 rpm离心30 min，用恒流泵将上清慢慢加入到预先用结合缓冲液平衡好的Ni-NTA亲和层析柱柱床上，上样完毕后分别用5 mM , 20 mM , 50 mM 咪唑的缓冲液洗涤柱子，然后用终浓度分别为100 mM和250 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。纯化过程中每个柱体积洗脱的组分都分开收集，最后用SDS-PAGE胶电泳检测蛋白纯化情况。
4. 可行性分析
（1）实验技术方法成熟：
项目指导教师在分子生物学、蛋白结构学等研究方面积累了丰富经验，实验技术方法成熟。本项研究已经计划完毕，步骤详细切实可行，工作量适中。
（2）试验条件与设备齐全：
具备本项目实施所需的各种实验技术方法及实验设备，实验条件成熟。
（3）申请者学习及科研兴趣浓厚：
申请者有相应的专业基础与专业素养，对研究课题充满兴趣，拥有良好的实验技能以及一定的实验经验；并且申请者具有不怕苦不怕累的精神，勇于进取。
4. 研究创新点
TtrRS是能够感受连四硫酸盐的双组分调节系统，对造成肠炎的沙门氏菌在肠道中竞争生长具有非常重要的意义，但是在其他细菌家族中还没有对连四硫酸盐呼吸进行过深入研究，此外TtrS如何感受连四硫酸盐信号也不清楚。本研究拟对沙雷氏菌FS14中TtrS组氨酸激酶（11880）如何感受连四硫酸盐信号进行研究，我们将通过分子生物学技术如PCR，基因克隆，蛋白的体外表达及亲和层析等方法，首先获得全长TtrS蛋白及胞外感受器结构域蛋白，为将来了解TtrS的结构进而了解其感受连四硫酸盐信号的机制奠定基础。
5. 研究计划与进展
2019年9月-2019年10月，查阅资料、文献，熟悉实验室基本操作；
2019年10月-2019年11月，感连四硫酸盐组氨酸激酶11880全长及胞外感受器结构域基因的克隆
2019年11月-2019年12月，感连四硫酸盐组氨酸激酶11880全长及胞外感受器结构域蛋白的表达。
