1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
（1）课题意义
吡蚜酮（pymetrozine）作为一种高效、低毒、高选择性、无交互抗性、对环境友好的新型吡啶甲亚胺类杀虫剂，以其优异的防治效果得到世界的广泛关注。吡蚜酮对刺吸式口器害虫，如粉虱、蚜虫、叶蝉和飞虱等有防治功效，利用电穿透图（epg）技术进行研究表明，一旦蚜虫或飞虱等害虫接触到吡蚜酮，将立即产生口针阻塞效应，阻断昆虫取食行为，最终饥饿致死，这是一个不可逆转的过程。并且吡蚜酮对鱼类、鸟类和哺乳动物安全性较高，市场价格低廉，被广泛应用于大田害虫的防治[1-3]。随着吡蚜酮的使用范围越来越广，在环境和农产品中检测出吡蚜酮的残留，对生态环境和人类健康构成了潜在的威胁。已报道吡蚜酮对人体的外周淋巴细胞有遗传毒性，美国环保局（usepa）已将吡蚜酮定义为人类可能的致癌物[4]。因此，人们日益关注吡蚜酮降解机制及代谢途径的研究，虽然目前已有人报道过吡蚜酮降解菌及其代谢途径，但有关分子机制还未有深入研究。本课题的研究能够为吡蚜酮污染环境的微生物修复提供菌株资源和理论依据，对解决吡蚜酮的安全问题具有重要的参考意义。
2. 研究的基本内容和问题
（1）研究目标
目前还缺乏性状稳定的吡蚜酮降解菌株，吡蚜酮的代谢途径及其分子机制也未进行深入研究。本课题的目标是分离吡蚜酮降解菌，解析其降解途径、克隆降解相关基因，以期为吡蚜酮污染环境的生物修复提供菌株资源和理论依据。
（2）研究内容
3. 研究的方法与方案
（1）研究方法
在实验室前期对吡蚜酮降解菌研究的基础之上，开展本课题的研究。本课题的研究内容为从农药厂污水处理系统的样品中分离筛选能以吡蚜酮为唯一碳源生长的菌株，测定其在一定条件下的对吡蚜酮的降解及生理生化特性，对该菌株16S rRNA基因序列进行相似性比较分析，初步对菌株进行鉴定并克隆吡蚜酮水解酶基因，并对该基因进行分析研究。
（2）技术路线
图1-3 本研究的技术路线
Fig 1-3 Technology roadmap of this study
（3）实验方案及可行性分析
制定实验方案如下：
1、吡蚜酮降解菌株的分离和鉴定
本研究拟采用微生物富集驯化技术分离吡蚜酮降解菌株，采用采集自农药厂污水处理系统的污泥样本，通过对农药厂废水污泥的连续富集培养，选用合适的培养基，进行吡蚜酮降解菌株的分离与纯化。对菌株降解吡蚜酮的效果进行初步测定，并研究其生理生化特征。对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增，测序并进行比对，对菌株进行鉴定。2、菌株降解吡蚜酮的特性及代谢途径解析
研究不同因素（温度、pH、菌株接种量和底物初始浓度）对菌株降解吡蚜酮能力的影响，寻找最佳的降解条件。对菌株的吡蚜酮代谢产物进行鉴定，研究其代谢途径。
3、吡蚜酮水解酶基因的克隆
方法一、根据本实验室之前筛选的菌株Pseudomonas sp. BYT-1的吡蚜酮水解酶基因bytH为模板设计引物来扩增本研究菌株中的吡蚜酮水解酶基因。
方法二、如果方法一步成功的话，则通过构建转座子插入突变文库克隆吡蚜酮的关键降解基因，利用 SEFA-PCR 的方法，扩增出 Tn5 转座子插入位置的上下游序列，然后经过测序和拼接，以期发现与吡蚜酮降解相关的基因。
可行性分析：
目前，国内外关于吡蚜酮的微生物降解已有报道，其降解吡蚜酮的途径也已做出了初步研究，但相关分子机制还不是很清楚。因此，为了更好的利用微生物和酶技术修复环境中或去除农产品中的吡蚜酮残问题，目前还缺乏降解性状稳定的菌株资源。现如今我们已经富集到一瓶具有降解吡蚜酮的富集液，其降解效果十分明显。而且成功的挑到一株能够降解吡蚜酮的菌株，该菌株已报道的降解菌株Pseudomonas sp. BYT-1来自不同的属。这为进一步探究吡蚜酮降解相关的机制提供了可能性，同时也为修复吡蚜酮的污染残留问题提供了重要的菌株资源。
4. 研究创新点
1、分离吡蚜酮降解菌株，研究该菌株降解吡蚜酮的方式，鉴定中间代谢产物，揭示吡蚜酮在菌株中的代谢途径，为吡蚜酮的微生物降解提供菌株资源。
2、克隆负责吡蚜酮起始降解步骤的水解酶基因。
5. 研究计划与进展
2020年2月 完成吡蚜酮降解菌株的分离、筛选及初步鉴定。
2020年3-4月 完成吡蚜酮降解菌株的降解特性
2020年4-5月 完成吡蚜酮水解酶基因的克隆
