1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporters）在植物中普遍存在，是一类重要的跨膜运输蛋白，利用结合并水解ATP所获得的能量参与多种底物分子的胞内或胞间运输。1992年在拟南芥中鉴定出了第一个ABC转运蛋白AtABCB1(又名AtM-DR1/AtPGP1)[1]，至今已在多种植物中鉴定出ABC转运蛋白。植物ABC转运蛋白参与植物体内一系列物质如激素、脂质、金属离子、次生代谢物、和外源物质的运输[2]，其中对于激素运输的报道尤为丰富。由于多样的转运底物，植物ABC转运蛋白直接或间接地影响到植物体内的许多生理活动，对植物的生长发育，生命活动有重要的影响。植物ABC转运蛋白在植物与微生物互作方面也有重要作用[2]。不同植物中ABC转运蛋白的分布和功能不尽相同，ABC转运蛋白定位于植物细胞中许多不同的部位，参与多种底物的运输，在植物体内有广泛的生物学功能。水稻作为我国重要的粮食作物，且作为完成基因组测序的一种植物，在科学研究中具有举足轻重的作用，水稻ABC转运蛋白的研究对水稻抗逆性研究，生长、代谢研究具有推动作用，并最终落实到水稻的品种改良，产量优化的实践意义上。
水稻ABC转运蛋白OsPDRx属于ABCG亚家族蛋白，PDR即多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance)，能够转运植物次生代谢物、生长调节物和金属离子，在植物受到外界非生物或生物胁迫时的防御过程中起到关键作用[3]。PDR类型也是ABC转运蛋白家族中数量最多的一个类型。有研究发现从大豆中分离出的GmPDR12基因在水杨酸及其功能类似物的诱导下能够快速并大量表达[4]，揭示了PDR型转运蛋白基因表达可能受一些激素影响。PDR亚族中的ABCG32基因表达产物还参与了植物角质层细胞壁的形成[5]，可见PDR型蛋白对植物生长也具有一定的影响。Alejandro等发现位于维管组织和内皮层细胞膜上的AtABCG29/PDR1, 在木质素单体转运过程中起到非常重要的作用，从而影响到木质素的合成[6]。拟南芥AtABCG36/AtPDR8/PEN3在根部表皮细胞质膜中表达，在重金属转运中起到作用[7]。拟南芥AtABCG31、AtABCG30和AtABCG40参与ABA在胚乳和胚中的运输，从而调控种子的萌发[8]。拟南芥AtPDR8在植株受到干旱和盐胁迫时表达增加，表达部位集中在地面部分组织中，其表达产物在多种抗原菌诱导的生物胁迫反应中起到作用[3]。Bessire等发现AtABCG32/PEC1/PDR4参与拟南芥细胞壁角质层的形成，并能将蜡质前体运出花瓣表皮细胞层，影响拟南芥花器官的发育[5]。近些年也有大豆、盐芥、忽地笑、红肉蜜柚中ABCG转运蛋白的克隆及表达分析研究[9][10][11][12]。迄今水稻中PDR型ABC转运蛋白的研究较为有限，本课题也能够充实水稻PDR型ABC转运蛋白研究基础。
2. 研究的基本内容和问题
研究内容主要为分析ospdrx基因在水稻各组织如根、茎、叶、穗中的表达水平，ospdrx基因主要表达于茎，在根、叶、穗中也有不同程度的表达；比较根、叶等组织不同生长阶段中ospdrx基因的表达水平差异，随着植株的生长，ospdrx基因在根、叶中的表达量会增加；ospdrx基因受激素me-ja（茉莉酸甲酯）诱导后的表达情况，ospdrx基因会受到茉莉酸甲酯的诱导表达；分析ospdrx基因的组织定位，ospdrx基因在叶片和根均有表达，主要表达于叶片的维管束和根的中柱；通过对野生型和突变体的表型鉴定，测定根与地上部分的长度和鲜重，分析ospdrx基因在调控水稻生长发育包括苗期和生长后期中的功能。
研究致力于确定ospdrx在水稻各组织中的定位，时空表达特性，既主要表达部位和不同生长阶段表达水平，是否受激素诱导表达，并结合突变体和野生型的表型差异推断ospdrx基因在水稻生长过程中的作用。
3. 研究的方法与方案
水稻幼苗采用水培，在昼夜温度分别为28℃和24℃、70%相对湿度和800 mmol m-2s-1光合有效辐射14小时的人工生长室内培养。
ospdrx基因在水稻组织中的定位通过gus染色后观察而得。首先构建gus材料，以野生型水稻基因组dna为模板，克隆rep1基因起始密码子atg上游2000bp片段，构建于带有gus的标签的pcambia1301载体上。经过菌落pcr和测序验证得到正确的重组质粒。将构建好的重组质粒，用电转法转入农杆菌eh105株系中，然后用农杆菌侵染水稻愈伤组织获得转基因材料。根据需求选取阳性gus转基因苗不同时期的不同组织，将其浸没于gus染色液中，用真空泵抽气30min，置于37°c过夜。叶片等绿色组织用75%乙醇脱色，将需要切片的组织用4%的琼脂糖包埋后用振动切片机切片。用体视显微镜观察。
ospdrx基因在水稻各组织中的表达水平通过定时荧光定量pcr而得。首先提取各组织样品中的rna，使用反转录试剂盒对rna进行反转录，以mrna为模板设计定量引物，以所得cdna为模板，以sybr green为荧光染料进行pcr反应。反应完成后，导出数据，以水稻act11基因为内参计算相对表达量。
4. 研究创新点
目前对于水稻中PDR型ABC转运蛋白的研究较为有限，此次研究通过GUS标签的插入，经染色观察可获得目标基因在水稻组织中的具体表达定位，与在各组织中的表达水平结合可为研究基因在水稻生长过程中起到的作用打下基础，配合表型鉴定作初步分析。
5. 研究计划与进展
通过阅读参考文献及自己的整理理清实验思路，在实验室中熟悉基本操作。首先在适当条件下培养野生型和突变株的幼苗，同时进行gus转基因材料的构建，培养。当材料生长到一定阶段时记录生理数据，取样进行rna提取，反转录，定时荧光定量pcr，gus染色观察等操作，获得数据及照片。根据时间灵活进行实验操作，时间分配，在顺利推进实验进度的基础上分析数据，撰写研究论文。
