1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 本课题的意义
如今出现的41种草甘膦抗性杂草导致了草甘膦已经不适合在有些土地上大量施用，否则不仅起不到防治杂草的作用，还会污染作物与环境。解决草甘膦杂草抗性最根本的措施就是换用其它除草剂并培育相应的抗除草剂作物，因此，发掘丰富多样的针对不同除草剂品种的除草剂抗性基因具有重要的应用价值。种植抗除草剂转基因作物是一种高效的杂草控制技术，可以大幅度降低劳动强度，提高生产效率，从而显著降低生产成本，因此，发掘丰富多样的针对不同除草剂品种的除草剂抗性基因具有重要的应用价值。
苞卫，又名苯吡唑草酮，是一种新型的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶（hppd）抑制剂类除草剂，广泛用于玉米田的杂草防治，能有效防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草。苞卫对环境安全性高、对作物安全性好且低毒高效，因此是一个理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。目前，来自多种植物、动物和微生物的的hppd基因已经被克隆和表达，但是抗性都比较低。此外，对于苞卫抗性的hppd目前仍鲜有报道。因此筛选出高苞卫抗性的菌株并克隆其抗性基因，为培育抗hppd抑制剂类除草剂作物提供高抗性基因资源，对推动我国农业生物技术创新和应用具有积极意义。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
筛选苞卫抗性菌株，在获得抗性菌株的前提下，克隆其抗性基因 hppd，并且通过基因工程手段、化学诱变以及驯化筛选等方式获得高抗性的 hppd 基因。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法
1.1筛菌土样的来源
实验所用土样来自于实验室现有土样以及本人在南京农业大学实验基地、乡下菜田采集。
1.2 酪氨酸基础无机盐培养基（TMSM）的配置
NH4NO3 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酪氨酸 1 g，去离子水 1 L ，pH 7.0（用NaOH调节）。
1.3苞卫抗性菌株单菌的分离
实验中，在得到具有苞卫抗性的菌落后，在2000 mg/L 苞卫的 TMSM 固体培养基上反复划线纯化，最终进行四区划线，得到单菌。
2 技术路线
3 实验方案
3.1 苞卫抗性菌株的分离
称采集的土样 10 g 加入 100 mL 的去离子水中，30℃、150 r/min 振荡 2 h 后取出静置 5 min，将土样稀释成10-1、10-2、10-3 g/ml的浓度梯度。土样分别取适量划线接种于 2000mg/L 苞卫的 TMSM 固体培养基中，挑取菌落形态不同的单菌落反复划线纯化。 称取采集的土样混合后取5 g加入100 mL无菌水中，150 r/min，30°C于摇床振荡培养1 h 后取出静置5 min，取5 mL上清液加入到100 mL TMSM液体培养基中，150 r/min，30°C摇床培养24 h。吸取1 mL培养液并稀释涂板于含2000 mg/L的的TMSM板上，稀释倍数为10-1、10-2、10-3 g/ml。挑取能在含平板上生长的单菌落反复划线纯化。
3.2 抗性菌株的 16S rNA 基因序列分析及系统发育地位的确定
参照细菌基因组 DNA 提取方法提取菌株基因组 DNA，采用细菌通用引物进行 16S rNA 基因的 PCR 扩增。通用引物序列为：
上游引物 Primers F：5′-TGGCGAACGGGTGAGTAATACAT-3′
下游引物 Primers R：5′-GCGGTTAGGCTAACTACTTCTGG-3′
PCR 扩增体系如下：
| 试剂 | 用量（μL） |
| Primers F | 2 |
| Primers R | 2 |
| 2×Taq Master Mix | 25 |
| DNA 模板 | 1 |
| dd H2O | 20 |
PCR 扩增程序如下：
| 温度（℃） | 时间 |
| 95 | 3min |
| 95 | 15s |
| 58 | 20s |
| 72 | 45s |
| 72 | 5min |
| 10 | 5min |
根据 16S rNA 基因的测序结果，在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 在线查询分析，利用 BLAST 软件在 GenBank 中与其他的 16S rNA 基因序列进行同源性比较，选取与其同源性较高的相关序列，ClustalW 软件进行多重序列比对后，采用 MEGA 6.0 软件分析，通过邻接法构建抗性菌株的系统进化树。
3.3 苞卫抗性基因 hppd的克隆及表达
根据 CodeHop 在线分析软件(http://blocks.fhcrc.org/codehop/codehop.html)设计简并引物 hppd-CODEHOP-F 和 hppd-CODEHOPR，用于扩增 hppd基因的保守区[14]。产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，连接 pMD19-T，转化E. coli DH5α，送样测序。以扩增出的 hppd基因的保守序列的菌株基因组 DNA 模板，根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov 在线查询分析同源性最高的已经报道的 hppd基因的全长序列设计一对引物扩增苞卫抗性菌 hppd基因的全长序列。
回收 hppd序列，连至用 Nde I 和 Xho I 双酶切线性化的载体 pET-29a ( ) ，转化 BL21 (DE3) 。将含有阳性重组质粒的 pET-29a ( ) 的表达菌株培养为 OD6000.4-0.6，加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，37℃、220 r/min 振荡诱导 8-12 h，离心菌体，经过超声波破碎，获得粗酶液，采用 Ni-NTA 亲和层析等方法来纯化蛋白，通过作用相应底物的酶反应设计来检测筛选获得的 HPPD 酶活性，通过在相应的酶反应体系中加入不同浓度的苞卫抑制剂来检测其抗性。
4 可行性分析
HPPD 抑制剂的特性引起了研究者们开发耐受 HPPD 抑制剂的转基因作物的兴趣，他们筛选并克隆了抑制剂抗性基因 hppd。如 Liang 等于 2008 年首次从黄连 (Coptis japonica) 培养细胞中克隆表达了具有 HPPD 抑制剂抗性的CjHPPD，DTP (吡唑类除草剂的活性形式) 和双环磺草酮 (三酮类除草剂) 对重组 CjHPPD 的 IC50分别为 6.75 μmol/L 和 2.34 μmol/L(LIANG, MINAMI, SATO, 2008)。Lee 等报道从土壤宏基因组中筛选得到 mHPPD，该 HPPD 能够耐受 20 μmol/L 磺草酮。这些文献的报道为我们的研究提供了很好的理论基础[13]。
4. 研究创新点
本研究致力于得到高抗苞卫的hppd基因，以往的研究中不同微生物和植物来源的 hppd 基因已经相继被克隆和表达，并且其蛋白结构也得到了完整的解析，但是苞卫除草剂抗性 hppd 基因的筛选和克隆鲜有报道。此外，以往苞卫抗性菌株的筛选常采用直接驯化的方法，其中不含HPPD的阳性菌不受抑制剂的影响，无法被筛除，极大地影响了筛菌的准确度。因此，本实验将土样稀释涂布于含2000 mg/L苞卫的TMSM平板上，再由革兰氏染色法筛选阴性菌，避免了阳性菌对实验造成的影响。
5. 研究计划与进展
2019年11月中旬前：查阅各种相关文献，设计实验方案；
2019年11月中旬至2020年4月底：获得高苞卫抗性的hppd 突变体，建立外源表达体系；
2020年5月：整理实验数据，撰写论文，准备论文答辩。
