1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
利用crispr系统建立灵芝基因敲除体系。
该体系在研究灵芝基因功能方面具有多方面的应用前景。
灵芝的研究意义：灵芝（学名：ganoderma lucidum karst），外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标：构建用于灵芝基因敲除的CRISPR载体，并将其转入灵芝表达2．研究内容：2.1 设计含有特定酶切位点的引物2.2 构建灵芝CRISPR载体经过多次转化，将Cas9基因与GPIE基因组装成新的载体1.3 利用农杆菌转化技术将载体转入灵芝1.4 检测在灵芝中之前构建的载体是否能表达
3. 研究的方法与方案
研究方法：（1）基因克隆：pcr技术，感受态制备，热激法，转化，碱裂法质粒提取2．技术路线以及实验方案：3. 可行性分析在本实验室（真菌实验室）灵芝研究中已经积累了丰富的经验，实验技术、方法成熟。
实验室成功建立了农杆菌转化等遗传操作手段，为下一步研究基因的功能提供优良的前提。
本项目的研究计划已经划分，步骤详细切实可行，工作量适中，可以在一年内完成课题，并完成结题报告。
4. 研究创新点
本项目以灵芝为材料，利用CRISPR系统建立灵芝基因敲除体系。
一般CRISPR技术在食用菌中应用较少，一般多见于植物和动物
5. 研究计划与进展
研究计划：见上条2.预期进展：1) Cas9质粒提取成功，GPIE质粒提取成功；2) 设计含有GPIE酶切位点及Cas9酶切位点的DNA双链引物3) 19T质粒上成功连入酶切位点；4) 切开新构建的含有所需酶切位点的19T质粒，得到含有特定Cas9酶切位点的质粒半环；5) 对Cas9质粒进行酶切；6) 将切下的Cas9质粒接入含GPIE酶切位点的T载体，形成完整的环；7) 对上一步得到的质粒进行酶切，得到一个含有Cas9目的基因以及GPIE酶切位点的片段；8) 酶切GPIE质粒；9) 将第六步的Cas9基因片段接入第七步的GPIE酶切载体中，构成载体；10) 农杆菌转化11) 检测载体是否能表达
