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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献） 1、研究背景及意义 流式细胞术( flow cytometry，FCM)[1]是利用流式细胞仪对生物颗粒( 细胞、细胞器、微生物)的多种物理和生物学特性进行定量分析，并根据测量的参数，将测量群体中的一个或两个亚群加以分选的细胞分析测量技术，是一种简单、快速、高通量检测植物倍性水平、种内杂交、单性生殖，以及基因组的大小、多倍体和性染色体的方法。 目前，FCM 在临床医学和基础医学研究领域的应用较为广泛，但在植物学研究领域中，由于植物组织与细胞结构复杂，适合流式细胞分析的植物单细胞悬液制备比较困难，使流式细胞术在植物科学中的应用滞后于其他学科[2]。1983年，Galbraith运用流式细胞术第一次成功测定了17种植物的核DNA含量[3]，开创了流式细胞术检测植物核DNA含量与倍性水平的先河。 FCM要求所提供的样本必须是完整的细胞或细胞核悬浮液。由于植物细胞不同于动物细胞，不仅具有细胞壁外，还有长期的进化以及适应生态环境所产生的大量次生代谢物，这就给制备样本增加了难度，大大降低了流式实验的成功率[4]。 所以目前虽然流式细胞术操作简单，但成功率极低。前期需大量预实验来确定最适实验条件，浪费许多时间和人力物力。因此对流式细胞仪快速鉴定植物倍性的通用方法进行探索十分必要,可提高倍性鉴定的成功率和 DNA 含量测定的准确度。
2、国内外研究进展 FCM作为一项高效的检测技术，目前在植物研究中应用最广泛的是检测细胞的核DNA含量和倍性水平。在用流式检测植物样品时，经常会遇到大量DNA碎片的干扰，主要原因是植物细胞结构（如细胞壁、中央液泡）及成分（次生代谢产物等）的特殊性和复杂性[5]。测试前对植物材料进行选择和样本制备是关系到流式细胞仪检测细胞核DNA成功与否的关键。一般植物取材需要考虑样品易获性、细胞核型的稳定性和保存性等一系列问题。植物样品最好选取新鲜的叶片或者幼嫩叶片，因其较易获得合适的单细胞悬液。Saito等[6]利用流式细胞仪对萱草属植物和栽培品种的叶、根、根状茎、花梗进行了倍性分析，发现叶基部组织是最合适的材料。 流式细胞术要求被检测的植物样本必须是完整的单细胞或细胞核悬液。在制备植物单细胞悬液时会产生大量的碎片，干扰细胞核DNA含量的检测。目前还未发现能适合于所有物种的通用解离液。Loureiro等[7]以芦苇作为材料比较了4种解离液（Galbraith's /LB01 /OTTO/Tris·MgCl2）的测试效果，发现LB01和OTTO解离液的效果最好。根据不同植物的组成特性，选择合适的植物细胞核解离液将有助于细胞核的完全游离。有些植物（臭椿、猕猴桃等）体内含有较多的酚类物质，在提取细胞核悬液时可以加入1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。Chen等[8]采用WPB缓冲液分析得到枸杞物种基因组的大小，枸杞果实含有许多酚酸类化合物和黄酮类化合物，会干扰细胞核DNA 荧光染色，加入偏亚硫酸氢钠和PVP可以防止酚和次级代谢产物的干扰。在草莓提取液中加入巯基乙醇，可以去除样品中酚类物质，使 DNA 与荧光物质很好地结合,能提高 DNA 悬浮液的质量[9]。 流式细胞仪可以通过内标和外标法进行植物倍性和细胞核DNA含量测定。常规的倍性分析多采用外标法，内标法可参照样本已知的染色体倍性，推算测试样品细胞核DNA的绝对含量，以避免因待测样品的变异和机器工作状态不稳定带来的误差。Roux等[10]以鸡血红细胞作为内参对照，用流式细胞仪检测了香蕉细胞核DNA含量和染色体数目；Phivnil等[11]用已知的大麦品种细胞核DNA含量作为对照鉴定了多个猕猴桃品种的倍性。 常用参照样本的倍性和细胞核DNA含量见参考文献[1,12]。
3、应用前景 FCM 是目前染色体倍性鉴别中最快速、有效的方法，还可以直接或间接测定细胞的 DNA 含量，从而快速鉴别植株的染色体倍性水平。
参考文献： [1]田新民，周香艳，弓娜. 流式细胞术在植物学研究中的应用[J].中国农学通报，2011,27(9):21-27 [2]汪艳, 肖媛, 刘伟, 李婷婷, 胡锐, 乔志仙. 流式细胞仪检测高等植物细胞核DNA含量的方法. 植物科学学报, 2015,33(1): 126-131. [3]Galbraith D. W., Harkins K.R., Maddox J. M., et al. Rapid flowcytometric analysis of the cell cycle inintact plant tissues [J]. Science, 1983, 220(4601): 1049-1051.5. [4]Jaroslav Dolezel, Johann Greilhuber, Jan Suda. Estimation of nuclearDNA content in plants using flow cytometry [J]. Nature Protocols, 2007, 2(9):2233-2244. [5]Jaroslav Dolezel, Johann Greilhuber, Jan Suda. Estimation of nuclearDNA content in plants using flow cytometry [J]. Nature Protocols, 2007, 2(9):2233-2244. [6]Stio H, Mizunashi K, Tanaka S, Adachi Y, Nakano M. Ploidy estimationin Hemerocallis speciesand cultivars by flow cytometry [J]. ScientiaHorticulturae, 2003, 97: 185－192. [7]Loureiro J, Rodriguez E, Dolezel J, Santos C. Comparison of fournuclear isolation buffers for plant DNA flow cytometry [J]. Ann Bot, 2006,98(3): 679－689. [8]Chen JJ, Liu XL, Zhu LY, Wang Y. Nuclear genome size estimation andkaryotype analysis of Lycium species[J]. Scientia Horticulturae, 2013, 151:46－50. [9]于 红 梅 , 王 静 , 赵密 珍 , 孟 宪 凤 . 利 用 流 式 细 胞 仪 检测 草 莓 倍 性 方 法 的 优 化 [J]. 南 方 农 业 学 报,2012,43(10):1530-1533. [10]Roux N, Toloza A,ＲadeckeZ, Zapata-Arias FJ, Dolezel J. Rapid detection of aneuploidy in musausingflow cytometry[J]. Plant Cell Rep, 2003, 21 (5): 483－490. [11]Phivnil K, Beppu K, Takamura T, Fukuda T, Kataoka I. Flow cytometricassessment of ploidy in native resources of Actinidia in Japan[J]. J. Am PomSoc, 2005, 59(1): 44－49. [12]Aliyu OM. Development of the flow cytometric protocol for ploidyanalysis and determination of relative nuclear DNA content in cashew[J]. Am JBiochem Mol Biol, 2012, 2(4): 200－215.
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2. 研究的基本内容和问题
| 研究的目标、内容和拟解决的关键问题
研究目标： 本实验将以梨幼苗为样品，从细胞核悬液的制备、解离液的选择、标准参照样品的确定、流式检测参数的设置等关键环节入手，探索各环节的关键影响因素，优化流程，减少碎片的产生，提高完整细胞核的比率。并运用到多个科不同种的植物，总结出一套完整详细的通用植物流式实验流程，提高倍性鉴定的成功率和DNA含量测定的准确度。
研究内容： （1）实验材料的选择 选取组织培养的梨嫩叶，用作参照的标准倍性植物选取绿豆、水稻、玉米、黑麦草等常见植物，培养箱内萌发种子至幼苗期取嫩叶。 （2）解离液的选择 因不同配方的解离液对植物核悬液的提取影响巨大，本研究选取常用的六种核悬液提取配方（GalbraIth法、LB01法、WPB法、OTTO法、GPB法、Tris/MgCl2），建立常规植物核悬液提取方法。 （3）细胞核的纯化 通过改变细胞核悬液制备过程中的不同步骤及试剂用量，对提取的核悬液进行完整细胞核的纯化，减少样本中的碎片率，提高完整细胞核的比例，降低流式直方图的CV值，提高倍性鉴定的准确度。 （4）流式参数设置 直方图可以根据植物倍性变化范围选择对数或线性形式；根据植物细胞的大小，调整FCS的阈值，排除杂质和背景信号的干扰；调整SSC的设置去除粘连细胞；设置合适的门，选取最佳分析对象，降低CV值。 （5）标准倍性和DNA含量参照的选择 选取几种常见已知倍性（二倍体、四倍体、六倍体）的植物作为标准参照，通过查阅文献获取其倍性和DNA大小并进行检测，测试其作为内标和外标的可靠性，为准确测定未知样本细胞倍性和DNA大小提供依据。
关键问题： （1）优化梨细胞核悬液制备方法。 （2）寻找一种适合更多植物的细胞核DNA悬液制备方法。 （3）测试几种标准倍性植物的倍性和DNA大小，建立标准内参和外参。
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3. 研究的方法与方案
| 研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
研究方法： （1）解离液的配制 配制Galbralth、LB01、WPB 、OTTO、GPB、Tris/MgCl2解离液（表1）。 表1 常用解离液种类及组分
（2）细胞核悬液的制备 取组织培养的梨细胞嫩叶(50 ～ 80mg),置于培养皿中加入 1 ml预冷缓冲液。并使用锋利刀片切碎,先用 70μm 过滤器过滤，再用 40μm 过滤器过滤，加入DNA荧光染料碘化丙锭(PI,propidium iodide,终浓度为 30μg/ml)及 Rnase(终浓度为 50μg/ml)。将制备好的细胞核悬液转入1 ml管中，黑暗下静置 10min，进行检测。 （3）流式细胞仪检测 经 PI 染色的样品通过流式细胞仪在 488 nm 激光的激发下发出桔红色荧光,由 FL3 通道检测荧光强度。
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| 不同实验材料 |
| 梨 |
| 不同解离液 |
| 流式细胞仪参数优化 |
| 细胞核悬液的纯化fangan |
| 探寻常用物种的倍性和DNA含量检测的最佳方案 |
| 其它标准参照样本（水稻、绿豆、黑麦草等） |
| GalbraIth法、LB01法、WPB法、OTTO法、GPB法、Tris/MgCl2 |
可行性分析
（1）已掌握流式细胞测定植物倍性的方法，并可熟练操作流式细胞仪。
（2）国内外在流式细胞术的条件优化上已有众多研究，可加以借鉴。
（3）前期已进行预实验，并初步取得成果。
4. 研究创新点
制备高质量的细胞核悬液是FCM检测植物倍性和DNA含量是否准确的最重要因素，目前对不同植物还没有一种统一的细胞核悬液制备方法。本实验通过探究制备细胞核悬液步骤中的关键因素，对操作方法进行改进，并对已有的一些纯化方法进行检验与整合，在此基础上总结出一套操作步骤更简便、检测结果更好、适用更广泛的细胞核悬液制备方法，以提高该实验的实用性和准确性。
5. 研究计划与进展
2018.07-2018.08 查阅相关文献，熟悉实验内容，掌握实验方法及流程
2018.09-2018.12 进行梨叶片制备细胞核悬液方法的优化
2019.01-2019.03 培养其他实验材料，尝试用不同实验材料制备细胞核悬液
