1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
在水稻的发育过程以及对生物性和非生物性逆境因素的抵抗中，细胞壁与细胞质之间有效的通讯是至关重要的，而在这其中植物类受体激酶（receptor-like kinases，rlks）起到了关键作用。rlks是目前植物中发现的主要的数目最大的一类受体蛋白，它是由三个部分构成，即胞外域、胞内域和连接两个区域的跨膜区，根据其胞外域的结构特点可将植物类受体激酶分成多种种类，如srk、waks、perks等等，而在这些酶类当中，细胞壁关联蛋白激酶(wall associated kinases, waks)对于水稻生长发育过程中对于外界环境中的逆境抵抗起到了关键作用。
细胞壁关联蛋白激酶(wall associated kinases, waks)是一类典型的可与细胞壁直接结合的类受体激酶蛋白,具有表皮生长因子(epidermalgrowth factor, egf)结构域、跨膜域、胞内丝/苏氨酸激酶域，它的胞外域与细胞壁成分直接相连，以及含有苏氨酸/丝氨酸激酶的11个保守区的胞内域。细胞壁关联蛋白激酶是由he等人于1996年在对其先前发现的一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（pro25）进行生化特征分析时发现，该蛋白与细胞壁紧密相连，因此该蛋白由pro25更名为wak1（wall associatedkinase1），由此首次提出了细胞壁关联蛋白的概念。他们将其定名为细胞壁关联蛋白激酶（wak）的证据包括：（1）wak1只有在去垢剂sds和强还原剂dtt共同存在并且加以煮沸才能从细胞壁上溶解下来，因而wak1应是与细胞壁紧密相连的；（2）应用免疫电子显微镜和免疫荧光技术可以观察到wak1定位在细胞膜和细胞壁；（3）对叶原生质体进行破裂和用蛋白酶消化处理后，在膜成分中仍能用抗体检测到wak1的存在，证明wak1是一个跨细胞质膜的蛋白激酶。以后的研究还表明，wak1与细胞壁中的果胶共价连接（wagner et al.,2001）。wak1的特性使人们大胆推测wak可能担当细胞壁与原生质体之间信息传递纽带，从而可能直接介导细胞外与细胞内的信息交换，进而对整个细胞进行调控。veronica和he（2002）用wak1的cdna和蛋白序列通过对拟南芥基因数据库进行搜索又发现了与wak结构非常相似的22个基因成员，他们把它命名为wak类似基因（waklike genes，wakls）。在这22个基因中，有5个编码小型wakl蛋白的基因(wakl7、wakl8、wakl12、wakl16和wakl19)。其它17个基因编码一个包含stk域的胞内域，一个跨膜域和一个包含钙结合的egf类似域（egf-ca2 ）和/或一个egf域的胞外域。为了更深入地了解植物wak基因家族的功能与进化，研究者还分析了水稻wak基因家族。通过生物信息学发现，水稻的基因组存在与拟南芥wak/wakl结构类似的基因（shiuet al.，2004）。zhang等人（2005）从日本晴中分离出125个属于水稻wak（oswak）基因家族的基因，这个数字远多于拟南芥。该结果显示在单子叶模式植物水稻和双子叶模拟植物拟南芥中，wak的功能可能存在差异。然而目前对于水稻wak的研究相对来说还很少，还需要更多的实验来了解水稻wak基因的功能和生化特性。wak家族不是唯独存在于拟南芥和水稻中的，利用wak抗体作为探针的蛋白质凝胶印记分析显示，它们与豌豆（pisum sativum）、 烟草（nicotiana tabacum）和玉蜀黍（ zea mays）中的蛋白有免疫学上的联系（he et al.,1996;gens et al.,2000）。lejeune等人（2006）还对番茄（lycopersicon esculentum）lewak进行了基因系统发育分析。waks的普遍分布也暗示了它们在植物生命过程中起着重要的作用。
发育过程中, waks的表达具有时空差异，外部环境的生物和非生物刺激也可以诱导wak基因的表达。不同wak家族成员的功能研究表明其在植株各种生理过程中都起到重要的作用,比如信号转导、生物胁迫、重金属胁迫、矿物营养响应、细胞伸长乃至整个生长发育过程，shiu和bleeker（2001）曾将植物类受体激酶按照生物学功能分为两大类，一类是调控植物生长和发育的类受体激酶，另一大类是参与植物与微生物相互作用和防御反应的类受体激酶，wak从功能上讲在两大类中都有存在。国内外的研究显示部分waks表达量的增加有助于增强植物对重金属离子的耐受性，如sivaguru等（2003）发现在拟南芥中过表达wak1，可以明显缓解了由铝胁迫引起的根生长抑制，报道认为wak1是一个受铝离子诱导的早期反应基因，而wak1表达量的增加提高了植物对铝的耐受性。但是这仅仅是针对铝离子，针对其它重金属离子如cu2 、cd2 、ni2 具体发生了表达变化的waks以及表达量的水平还是未知，需要深入研究。
本课题的意义在于找出能够对重金属离子cu2 、cd2 、ni2 胁迫产生响应的waks并在构建这些waks的水稻缺失突变体以做后续研究。克隆与表达特性分析往往是了解类受体激酶蛋白的首要步骤，水稻基因组测序的完成为在基因组水平上开展水稻激酶功能研究提供了必要条件，也为大规模克隆水稻激酶基因提供了可能，其应用前景在于这些waks对于重金属离子cu2 、cd2 、ni2 胁迫的响应能够让研究人员更加了解水稻的耐受性机理，为发展针对重金属的抗逆性水稻做出参考以及贡献。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：在通过转录组学的方法筛选响应重金属胁迫的wak家族基因的基础上，用荧光定量pcr的方式再次确定相关wak家族基因的表达量变化，然后构建相关基因的突变体材料，为后续确定确定这些基因是否在植物相应重金属胁迫中起作用打下材料基础。
研究内容：在于通过重金属ni2 、cd2 、cu2 处理水稻植株然后进行mrna的提取以及qrt-pcr检测其中的wak表达状况，找出表达发生变化了的wak然后利用crispr/cas9
技术构建在重金属胁迫下表达量发生变化wak的突变体。
3. 研究的方法与方案
本研究所用到的研究技术和方法有qRT-PCR，Crispr/Cas9，载体的构建，大肠杆菌转化，农杆菌转化，水稻材料的构建。
试验方案：
1.利用转录组数据初步筛选在重金属处理下，表达量发生变化的WAK家族基因。
2.荧光定量PCR技术进一步确认转录组数据是否正确。
3.选择表达量变化显著的基因，构建敲除载体。进行大肠杆菌的转化，农杆菌的转化。
4.准备水稻愈伤，进行农杆菌的浸染，筛选抗性愈伤组织，进行再分化，得到水稻材料，提取水稻DNA验证突变体材料是否构建成功。
可行性分析：其中qRT-PCR用于分析基因的表达状况而Crispr/Cas9用于基因编辑。
这两种技术都是目前在生物学领域被广泛采用的，因此具有非常高的可能性。
4. 研究创新点
本研究的创新之处在于将水稻中的WAK基因与重金属的胁迫相联系进行研究，从而为如何提高水稻对于重金属胁迫的抗逆性提供了全新的视角和参考。在此之前，虽然已经有研究发现某些WAKs家族基因能够对重金属的胁迫产生应激表达，但是具体是那些WAKs以及其表达的水平如何都是未知的，而本课题能够涉及这一未知方向，进而做出更为具体和新颖的研究分析。同时本课题能够使用生物科学研究领域的前沿技术，如qRT-PCR以及Crispr/Cas9，进而从分子生物学基因表达的层面对水稻的重金属抗逆机制做出研究，因此具有创新特色。
5. 研究计划与进展
研究的计划为在2018年10月至11月间进行水稻的培养与重金属处理。在2019年1月至2月期间进行水稻的mRNA提取以及qRT-PCR的检测。在2019年2月至5月期间进行愈伤组织的培养与突变体的构建培育。目前进展为已将水稻的mRNA提取完毕并准备进行qRT-PCR的检测，与预期进展相符合。
