缺钾条件下施钾烟草位叶之间的钾转运机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 本课题研究意义

烟草是双子叶纲,管花目,茄科,烟草属植物。作为世界范围内广泛种植的重要经济作物,烟草在中国种植面积广阔,目前中国是世界上烟草第一种植大国。但中国烟叶质量总体来说与世界优质烟生产国家的烟叶质量尚有较大差距,钾含量较低是一个重要方面^[1]。

烤烟品质是由其遗传基因和环境因子共同决定。土壤矿质营养和施肥是决定其品质的最主要环境因子。而钾含量是决定烟叶品质好坏的一个关键因素, 被称为烟草的品质元素^[2]。这是由于钾在植物体内的作用所决定的^[8]。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究的目标

1.1对缺锌烟草植株的不同叶位面涂抹2% kno₃溶液， control组（全营养液培养）与-k组（缺钾营养液培养）比较上叶位、中叶位、下叶位钾含量的异同，观察对缺钾植株施涂抹钾营养液后，同时间点钾离子在各叶位片的分布、变化，积累和转运情况。

1.2 通过测定在缺钾胁迫下，在涂抹2% kno₃溶液2天后，检测不同叶位的1种钾离子通道的基因表达情况，初步筛选参与叶位叶片间钾离子转运的基因，明确其表达情况，建立起钾离子含量与基因表达的关系。

3. 研究的方法与方案

1 研究方法

1.1. 水培方法 制完全培养液和缺素培养液，把生长状况一致的植株分别放在不同的营养液中并处于同样的环境中培养，记录并观察。

1.2. 涂抹叶面肥 配置2% KNO₃溶液，对缺钾烟草进行叶面涂抹处理，涂抹至叶片正反两面湿润为止。并设置3次重复。

1.3. 消煮法 对消煮管进行清洗，保证干净，加入0.2g样品和消煮液(硝酸：高氯酸=87:13)5ml进行消煮至结晶，酸溶解，稀释。

1.4. AAS测量钾元素含量 使用AnalytikJena novAA400P 原子吸收光谱仪通过火焰法(AAS)测量钾元素含量。

1.5. RT-PCR 提取扩增缺钾条件下已知的烟草表达的六种钾离子通道的DNA。

1 实验方案及可行性分析

3.1烟草种植

本实验中选取的烟草种子为MS K326烟草催芽包衣种子，在蛭石中育苗，放置于光照培养架，待发芽后，每天喷水，或者涂抹全素营养液，观察烟草幼苗生长状况，待植株长大且保持大致相同的长势，转移植株到塑料烧杯进行水培。

3.2水培

用深14.8cm、内径12.1 cm，量程为1L，容积约为1.5 L 的圆柱形塑料烧杯盛放营养液，在生科楼C7013 25℃光照培养室培养。水培营养液为Hoagland 全素营养液为全素营养液，各元素质量浓度为（mg/L）：KNO₃ 510.00 mg/L，Ca(NO₃)₂4H₂O 1180.00 mg/L，KH₂PO₄ 140.00 mg/L，MgSO₄7H₂0 490.00 mg/L，H₃BO₃ 2.90mg/L，MnCl₂4H₂O 1.80 mg/L，CuSO₄5H₂0 0.08 mg/L，ZnSO₄ 0.22 mg/L，H₂Mo0₄ 0.02，FeC₄H₄O₆ 5.00mg/L。缺钾营养液将KNO₃及KH₂PO₄更换为浓度为424.98 mg/L的NaNO₃及120mg/L NaH₂PO₄。水培一个月，待植株长大，准备进行缺素处理。

3.3缺素处理

更换水培液，提供缺乏钾元素但其他营养物质相同的缺素营养液水培植株至烟草苗出现缺素症状，下部叶片变黄、枯萎，植株矮小等现象。

3.3叶面涂抹钾营养液

配置浓度为2% KNO₃溶液，对经缺素处理的烟草中叶位涂抹钾营养液，使叶片湿润。涂抹1次，3次重复。

设置对照组全素营养液（Control）培养,设置缺素对照组（-K），涂抹清水，3次重复。

3.4采样收集

取样时挑选生长一致的植株，取处理叶片中叶位、上叶位与下叶位，在清水中润洗后擦干，收入编号的纸袋中，80℃烘干至恒重。取样时间：叶面涂抹后,2天。

同时收集进行mRNA的实验0.2mg样品。零下20度保存待用

3.5 数据测定与分析

称取样品干重0.2克，滴加酸，进行消煮至结晶出现，2.5%硝酸溶解，稀释，AAS测定钾元素含量，并数据分析

3.6收集烟草各叶位样品总RNA

0.2mg中提取0.1mg在aKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit进行烟草叶位总 RNA 的提取。根据NCBI或者Genbank搜索烟草的钾离子通道蛋白的mRNA序列，设计引物。得到引物序列。

1.7 RT-PCR

根据mRNA与引物在SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)内进行RT-PCR操作

可行性分析

实验室能提供充足的环境与实验材料仪器，有丰富的植物水培经验。同时指导老师陈亚华老师有丰富的相关方面的知识和经验，为实验的顺利进行提供了充足的保障。

4. 研究创新点

5 特色或创新之处

5.1初步探究在缺钾条件下，烟草叶位之间钾转运情况。

5.2初步明确在缺钾与正常条件下，烟草不同叶位叶位之间的6种基因表达

5. 研究计划与进展

2016年4月到2016年6月：实验材料种植，实验前期准备

2016年6月到2016年7月：对实验材料进行缺素处理

2016年8月到2016年12月：对烟草叶面喷施钾营养液