Corallococcus sp. EGB来源的麦芽糖淀粉酶AmyZ的克隆表达及酶学性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题研究意义麦芽糖在食品、饲料、药物、生物医学和精细化学等领域具有广阔的应用前景。

以淀粉为原料生产麦芽糖有多种方法，淀粉酶法是高纯度麦芽糖生产中最主要的方法，其中麦芽糖淀粉酶是一种产麦芽糖的主要α-淀粉酶类。

目前对于高产麦芽糖淀粉酶的研究报道相对较少，已报道的麦芽糖淀粉酶离工业应用的要求还相距甚远，提高酶的催化效率和降低副产物的产生是扩大工业酶应用范围和降低成本的有效途径。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标 本课题从粘细菌egb中克隆麦芽糖淀粉酶并进行酶学性质研究，以期获得高产麦芽糖淀粉酶，为生产高品质麦芽糖浆提供酶制品。

2.研究内容2.1粘细菌中麦芽糖淀粉酶基因amyz的扩增 寻来源于粘细菌并且注释为麦芽糖淀粉酶的orf的dna序列为模板设计引物，以提取的粘细菌的基因组dna为模板，加入设计好的引物，进行pcr扩增。

2.2表达载体pet-29a-amyz的构建以及重组酶amyz的表达纯化将扩增获得amyz基因与表达载体pet-29a进行双酶切连接，构建表达载体pet-29a-amyz，并转化至大肠杆菌e.coli bl21（de3）。

3. 研究的方法与方案

1. 实验方案及方法1.1表达载体 pet-29a-amyz的构建1.1.1粘细菌dna的提取 采用naoh一ctab法对粘细菌的总dna进行提取。

1.1.2 amyz基因的扩增 以粘细菌的基因组dna为模板，设计引物，amyz-f1和amyz-r1。

pcr 反应体系(50 μl)如下：5 primestar buffer (mg2 plus) 10.0 μldntp mixture(2.5mm) 4.0μlamyz-f11.0 μlamyz-r11.0 μl模板 dna(corallococcus sp.egb，20ngμl-1 ) 1.0 μlprimestar hs dna polymerase 5 uμl-1 0.5 μl无菌 ddh2o32.5 μl反应总体积 50.0 μlpcr 扩增程序：98 ℃ 10 s，57℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃10 min。

4. 研究创新点

粘细菌是新型药源微生物类群，在新药筛选具有巨大的潜力，但对其基因组中丰富的功能基因研究较少。

本课题通过挖掘粘细菌来源的麦芽糖淀粉酶，为高纯度麦芽糖工业生产提供微生物和基因资源。

5. 研究计划与进展

2016年11月：粘细菌DNA的提取和amyZ基因的扩增； 2016年12月-2017年1月上旬：表达菌株的构建，AmyZ的表达与纯化 2017年2月下旬-2017年4月上旬：AmyZ的酶学性质检测 2017年4月下旬：总结实验，分析数据，撰写论文。